Пропускная способность сип: Пропускная способность провода сип — Морской флот

Содержание

Провод СИП-4 4х70

СИП-4 4х70 - провод самонесущий изолированный с 4 алюминиевыми жилами сечением 70 миллиметров квадратных, в изоляции из светостабилизированного сшитого полиэтилена.

Технические характеристики провода СИП-4 4х70

Климатическое исполнение самонесущего изолированного провода СИП-4 4*70: В, 1,2 и 3 категории размещения по ГОСТ 15150-69.
Диапазон температуры эксплуатации провода самонесущего СИП-4 4х70 от -60 до +50 градусов.
Монтаж самонесущего изолированного провода СИП-4 4х70 производится при температуре не менее -20 градусов.
Температура жил при эксплуатации СИП-4 4*70 не должна превышать 90 градусов в нормальном режиме и 250 в режиме короткого замыкания.
Расчетная масса провода СИП-4 4х70: 0,983 килограмм в метре.
Срок службы самонесущего провода СИП-4 4х70 не менее 40 лет.
Наружный диаметр провода СИП-4 4*70: 30 миллиметров.
Активное сопротивление жилы провода самонесущего изолированного СИП-4 4х70: 0,568 Ом на километр.
Допустимая токовая нагрузка СИП-4 4х70: 240 Ампер.
Минимальный радиус изгиба при монтаже провода самонесущего изолированного СИП-4 4*70: 256 миллиметров.

Конструкция провода СИП-4 4х70

1) Жила - алюминиевая многопроволочная, уплотненная.
2) Изоляция - из светостабилизированного сшитого полиэтилена.
3) Скрутка - жилы скручены между собой.

Применение провода СИП-4 4х70

Провод самонесущий изолированный СИП-4 4*70 предназначен для ответвлений от магистральных линий электропередачи к вводу и для прокладки по стенам зданий и инженерных сооружений на номинальное напряжение до 1000 Вольт включительно, номинальной частотой 50 Гц в атмосфере воздуха II и III по ГОСТ 15150-69, в том числе на побережьях морей, соленых озер, в промышленных районах и районах засоленных песков.

  • Марка?СИП-4
  • Количество жил?4
  • Сечение жилы (мм/кв)?70
  • Материал жилы?Алюминий
  • Материал изоляции?СПЭ
  • Материал оболочки?СПЭ
  • Максимальный вес (кг/м)?0. 983
  • Максимальный наружный диаметр (мм)30
  • Электрическое сопротивление жилы (ом/км)0.568
  • Допустимый радиус изгиба (мм)256
  • Допустимая токовая нагрузка при прокладке на воздухе (А)240
  • Допустимый ток односекундного короткого замыкания (кА)6.5
  • Номинальное переменное напряжение (кВ)1
  • Диапазон температур эксплуатации (°С)от -60 до +50
  • Срок службы40
  • Код ОКП355 332
  • Максимальная температура эксплуатации (°С)50
  • Минимальная температура эксплуатации (°С)-60
  • Максимальная мощность при прокладке в воздухе, 220V (кВт)70.4
  • Максимальная мощность при прокладке в воздухе, 380V (кВт)157.92
  • ГОСТ31946-2012
  • Минимальная температура монтажа20
  • Код товараСИП-4 4х70
  • Количество основных жил4
  • Сечение основных жил (мм2)70
  • Число проволок в основной жиле7
  • Наружный диаметр основной жилы (мм)9.95
  • Электрическое сопротивление основной жилы (ом/км)0.443
  • Допустимые токовые нагрузки основных жил (А)240
  • Допустимый ток односекундного короткого замыкания основных жил (кА)6. 5

Выбор сечений изолированных проводов СИП

Сечения изолированных проводов СИП до 1 кВ выбирают по экономической плотности тока и нагреву при числе часов использования максимума нагрузки более 4000 - 5000, при меньшей продолжительности максимума нагрузки — по нагреву. Если сечение провода, определенное по этим условиям, получается меньше сечения, требуемого другими техническими условиями (механическая прочность, термическая стойкость при токах КЗ, потери напряжения), то необходимо принимать наибольшее сечение, требуемое этими техническими условиями.

При выборе сечений СИП по нагреву следует учитывать материал изоляции провода: термопластичный или сшитый полиэтилен. Допустимые температуры жил проводов с различной изоляцией для различных режимов работы приведены в табл. 1. 

Таблица 1. Конструктивные и стоимостные характеристики изолированных проводов

 

Изоляция из сшитого полиэтилена более термоустойчива, чем из термопластичного полиэтилена. В нормальных режимах работы температура жилы с изоляцией из термопластичного полиэтилена ограничена 70 °С, а с изоляцией из сшитого полиэтилена — 90 °С.

Режим перегрузки СИП допускается до 8 ч в сутки, не более 100 ч в год и не более 1000 ч за весь срок службы провода.

Соответствующие допустимой температуре допустимые длительные токи Iдоп для различных конструкций СИП приведены в табл. 2 и 3. Здесь же указаны омические сопротивления фазной и нулевой жил и предельные односекундные токи термической стойкости.

Табл. 2. Электрические параметры проводов СИП-1, СИП-1А (СИП-2, СИП-2А)

 

Табл. 3. Электрические параметры проводов СИП-4

 

Табл. 4. Допустимые длительные токи изолированных проводов

 

Для сопоставления в табл. 4 приведены допустимые длительные токи неизолированных проводов. Провода СИП напряжением до 1 кВ допускают меньшие токовые нагрузки, чем неизолированные провода. Провода СИП охлаждаются воздухом менее эффективно, поскольку имеют изоляцию и скручены в жгут.

 

Провода с изоляцией из сшитого полиэтилена в 1,15 - 1,2 раза дороже проводов с изоляцией из термопластичного полиэтилена. Однако, как видно из табл. 2 и 3, СИП с изоляцией из сшитого полиэтилена имеют в 1,3 - 1,4 раза большую пропускную способность, чем провода такого же сечения с изоляцией из термопластичного полиэтилена. Очевидно, что выбор сечения СИП следует проводить на основе технико-экономического сравнения вариантов с различной изоляцией.

Рассмотрим конкретный пример выбора сечения СИП по расчетному току Iрасч = 140 А.

В соответствии с исходными данными табл. 2 можно принять два варианта СИП:

СИП-1А 3x50 + 1x70, Iдоп = 140 А; изоляция — термопластичный полиэтилен;

СИП-2А 3x35 + 1x50, Iдоп = 160 А; изоляция — сшитый полиэтилен.

Очевидно, что экономически целесообразно принять СИП-2А 3x35 + 1x50 с изоляцией из сшитого полиэтилена:

Таким образом, фактически осуществляется замена провода СИП-1А на провод СИП-2А меньшего сечения и меньшей стоимости. Благодаря этой замене:

  • уменьшается масса провода;

  • уменьшаются габариты провода и соответственно снижаются гололедно-ветровые нагрузки на провод;

  • увеличивается срок службы ВЛИ, так как сшитый полиэтилен долговечнее термопластичного полиэтилена.

Технические параметры провода СИПн-4 соответствуют параметрам провода СИП-4. Провод СИПн-4 с изоляцией, не распространяющей горение, следует применять в условиях с повышенными требованиями по пожарной безопасности:

  • для вводов в жилые дома и промышленные постройки;

  • при прокладке по стенам домов и зданий;

  • в зонах с повышенной пожарной опасностью.

Если выбор провода СИПн-4 определяется исходя из требований пожарной безопасности, то выбор между проводами марки СИП-4 и СИПс-4 производится технико-экономическим сравнением вариантов.

Для проверки сечений на термическую стойкость при токах КЗ в табл. 2 и 3 приведены допустимые односекундные токи термической стойкости Iк1.

При другой продолжительности КЗ допустимый ток термической стойкости определяется умножением тока Iк1 на поправочный коэффициент

 

где t — продолжительность КЗ, с.

По условиям механической прочности на магистралях ВЛИ, линейных ответвлениях и ответвлениях к вводам следует применять провода с минимальными сечениями, указанными в табл. 5. При проверке сечений СИП по допустимой потере напряжения необходимо знать погонные параметры провода. Омические сопротивления СИП приведены в табл. 11 и 2, индуктивные сопротивления — в табл. 6. 

Табл. 5. Провода ВЛИ с минимальными сечениями (пример) 

 

Табл. 6. Индуктивные сопротивления многожильных проводов СИП 

 

Следует отметить, что индуктивные сопротивления неизолированных проводов ВЛИ составляют Xо = 0,3 Ом/км.

Благодаря меньшим реактивным сопротивлениям потери напряжения в линии с СИП будут меньше, чем в линии с неизолированными проводами при прочих равных условиях.

Сечения защищенных изоляцией проводов напряжением выше 1 кВ выбираются по экономической плотности тока. Выбран- ные сечения должны удовлетворять требованиям допустимого нагрева, термической стойкости при токах КЗ, механической прочности, допустимой потере напряжения.

Допустимые температуры нагрева защищенных изоляцией проводов (СИП-3, ПЗВ, ПЗВГ) приведены в табл. 1, электрические параметры этих проводов — в табл. 7 и 8.

Сечения защищенных изоляцией проводов напряжением выше 1 кВ выбираются по экономической плотности тока. Выбран- ные сечения должны удовлетворять требованиям допустимого нагрева, термической стойкости при токах КЗ, механической прочности, допустимой потере напряжения.

Табл. 7. Электрические параметры проводов СИП-3 

 

Табл.

8. Электрические параметры проводов ПЗВ и ПЗВГ 

 

Табл. 9. Провода BЛЗ с минимальными сечениями (пример)

 

Сечения защищенных изоляцией проводов напряжением выше 1 кВ выбираются по экономической плотности тока. Выбранные сечения должны удовлетворять требованиям допустимого нагрева, термической стойкости при токах КЗ, механической прочности, допустимой потере напряжения.

Допустимые длительные токи защищенных изоляцией проводов выше, чем неизолированных проводов. Это объясняется хорошими условиями охлаждения одножильных изолированных проводов, а также более благоприятными условиями работы контактных соединений по сравнению с контактными соединениями неизолированных проводов. На ВЛИ и ВЛЗ все контактные соединения герметизируются.

Термическая стойкость изолированных проводов напряжением выше 1 кВ проверяется так же, как изолированных проводов напряжением до 1 кВ.

 

По условиям механической прочности на ВЛЗ следует применять провода с минимальными сечениями, указанными в табл. 9.

Преимущества SIP телефонии и особенности выбора SIP телефонов!

Новые технологии для корпоративной связи появляются часто, но Session Initiation Protocol (SIP) — одна из самых интересных новинок последних двух десятилетий. Она уже используется многими компаниями и предлагает удивительное разнообразие возможностей.

SIP-телефония тесно связана с VoIP — голосовой связью через протокол IP, но при этом имеет более обширный функционал. Протокол SIP использует адрес, похожий на адрес электронной почты, поэтому адрес обычно называют SIP-аккаунтом. Вне зависимости от местонахождения, номер и стоимость звонка SIP останутся неизменными — достаточно лишь подключения к интернету.

У SIP гораздо больше возможностей, например, видеовызовы, рассылка мультимедиа и сообщений. Соединение происходит через интернет, причем с помощью мобильного приложения можно легко подключить смартфон сотрудника к корпоративной сети. Одновременно стационарные SIP-телефоны остаются такими же простыми в использовании, как и обычные.

Главное преимущество в том, что это очень гибкая технология. Она позволяет легко добавлять новые инструменты, которые появятся в будущем. Также она мобильна: SIP-телефоны достаточно перевезти на новое место и подключить к интернету. При этом функции резервного копирования сократят до минимума время запуска телефонов в работу.

Также многие пользователи SIP отмечают снижение финансовых затрат на коммуникации — в среднем на 30%. Это особенно заметно для компаний, которые имеют дело с множеством междугородних звонков. На базе технологий SIP можно маршрутизировать звонки через разные офисы внутри компании и через интернет соединить в единую коммуникационную сеть телефонные линии предприятий, даже если они находятся на разных континентах.

Пример развертывания и решенные проблемы

Один из крупнейших примеров развертывания SIP продемонстрировала компания AXA. Это одна из самых больших в мире страховых компаний с 300-летней историей, множеством офисов в 64 странах и 166 тыс. сотрудников. У компании более тысячи колл-центров, загруженных  работой по взаимодействию со 100 млн клиентов.

В колл-центрах AXA была установлена цифровая сеть ISDN, объединяющая сервисы голосовой связи и передачи данных. Но даже она уже не удовлетворяла потребности современного бизнеса. Линии ISDN были негибкими — требовались недели на подключение новых каналов и отключение старых, нерентабельных. В итоге телефонная сеть приносила большие расходы.

После внедрения SIP-телефонов расходы на голосовую связь сократились на 75%. Главным преимуществом стала возможность быстро добавлять и сокращать количество каналов, реагируя на краткосрочные изменения на рынке. Например, раньше экстремальные погодные явления приводили к 100-процентному росту количества обращений в колл-центры страховой компании. С появлением SIP в такие периоды можно очень быстро увеличить количество каналов и сократить время работы в чрезвычайном режиме.

Дополнительно стали доступны новые инструменты для работы с клиентами. В частности, выбор географического индикатора, который делает номер похожим на региональные номера. Такой более узнаваемый номер кажется доступнее и увеличивает количество обращений потенциальных клиентов.

Возможности SIP телефонов

Современные стационарные телефоны с поддержкой протокола SIP, такие как ATCOM A48W, лишены главного недостатка — необходимости подключения витой пары к каждому аппарату. У них беспроводное подключение по Wi-Fi, а значит, рабочее место можно организовать очень быстро, в том числе и мобильное.

 Телефон ATCOM A48W с гарнитурой в комплекте

У телефона восемь клавиш быстрого набора с индикаторами занятости линии (BLF) и цветной дисплей, который может отображать фотографии сотрудников или наиболее важных клиентов, загруженные в телефонную книгу. Телефон оснащен качественными микрофоном и динамиком для организации конференц-связи с хорошей слышимостью голоса на расстоянии до 5 м.

Разумеется, присутствуют все необходимые инструменты, такие как удержание вызова, анонимный звонок, групповой вызов, запись разговора и т. д.

Телефон ATCOM A48W поддерживает современные стандарты Wi-Fi IEEE 802.11b/g/n. Защита данных обеспечивается множеством технологий: стандартами EEE802.11i и IEEE802.1X, протоколом защиты трафика SRTP (RFC3711), шифрованием AES, уровнями пользовательского доступа и т. д.

При необходимости возможности телефона ATCOM A48W можно расширить с помощью дополнительного 4,3-дюймового дисплея ATCOM AET с 16 функциональными кнопками BLF. На экран можно вывести фото и статус абонентов, а на кнопки запрограммировать до 44 действий. К одному телефону ATCOM A48W можно подключить до пяти таких экранов и превратить SIP-телефон в мощную рабочую станцию с быстрым доступом к почти сотне контактов.

Дисплей ATCOM AET и телефон ATCOM A48W с присоединенным дисплеем

Таким образом, современные телефоны SIP имеют максимальный функционал, необходимый для корпоративных телефонных сетей любого размера.

Технические особенности использования SIP

Надо понимать, что любой вид VoIP-телефонии — это, фактически, услуга. Внутри предприятия можно использовать широкие возможности таких технологий, как SIP, и бесплатную связь через интернет. Если же с SIP-телефона надо звонить на обычный, придется использовать SIP-транкинг. Обычно посредники-поставщики услуг транкинга в случае с SIP взимают плату не за отдельную линию, а за количество вызовов, что выгоднее для пользователей. По оценкам Gartner, SIP-транкинг сокращает расходы примерно на 50% по сравнению с традиционными телефонными услугами. Количество одновременно обрабатываемых вызовов можно увеличить очень быстро, в отдельных случаях всего за сутки.

Как работает SIP-транкинг

Очень важно учесть требуемую пропускную способность интернет-соединения предприятия. Качественная голосовая связь требует скорости 80-100 Кб/сек. Для правильного расчета необходимо сосчитать общее количество возможных одновременных звонков и умножить его на 100. К получившемуся числу надо добавить скорость, требуемую для других потребителей, помимо связи. Итоговый показатель требуемой скорости должен быть ниже скорости существующего интернет-соединения. В противном случае в периоды пиковой нагрузки возможны сбои в работе сервисов.

Пропускная способность канала связи, по сути, является единственным ограничением емкости телефонной сети SIP. На одном телефоне SIP можно использовать множество адресов (аккаунтов). Количество зависит от модели телефона, например, некоторые SIP-приложения для смартфонов позволяют принимать звонки на 32 аккаунта. Проще говоря, в одном устройстве десятки номеров, каждый из которых может быть выделен как отдельный сервис или доверенный номер для отдельной группы клиентов. Аккаунты SIP можно привязать к учетной записи мессенджеров, и абоненты могут позвонить на телефон SIP, например, через кнопку Skype на сайте или в смартфоне.

Почему удобно иметь много SIP аккаунтов в телефоне

На каждый SIP-телефон может приходиться несколько SIP-адресов, и при этом телефон может принимать одновременно несколько звонков (обычно 6-8) и организовывать конференц-связь между ними. Это дает большие возможности. Например, даже относительно простой и доступный по цене телефон ATCOM A21 можно зарегистрировать на шести SIP-аккаунтах.

SIP телефон ATCOM A21

Максимальное количество одновременных вызовов важно для центров сервисной поддержки и других отделов, которые принимают множество звонков. В таких случаях телефон с несколькими SIP-аккаунтами позволит принимать звонки на разные номера, быстро оценивать по индикаторам BLF, свободны ли другие сотрудники, и перенаправлять звонки в случае необходимости. Если у офис-менеджера большой круг задач и контактов с разными отделами, количество программируемых кнопок расширяется с помощью дополнительных дисплеев, таких как ATCOM AET.

Для определенных категорий сотрудников целесообразно настроить переадресацию между стационарным офисным SIP-телефоном и SIP-приложением на смартфоне. Это обеспечит непрерывную связь по одному номеру для дистанционных работников, ремонтных бригад и т. д.

Для руководителей необходимы SIP-аккаунты для разных групп абонентов. Так, отдельный аккаунт понадобится для личных звонков от семьи и друзей, еще один — для звонков на номер, указанный на визитке. Также аккаунты могут обеспечивать отдельные номера для связи с членами совета директоров, юристами, аудиторами и другими контактами за пределами компании.

Таким образом, SIP-телефония соответствует всем современным требованиям корпоративной связи любого уровня. Телефоны с поддержкой SIP – долгосрочная инвестиция с  возможностью значительной экономии ресурсов предприятия.

Настройка SIP-транка и VoIP-провайдера для работы с АТС 3CX

Настройка SIP-транка / VoIP-провайдера

Введение

Для того, чтобы делать вызовы на внешние номера, к системе 3CX необходимо подключить хотя бы один SIP-транк / VoIP-провайдер или VoIP шлюз.

VoIP-провайдеры / SIP-транки (операторы связи) предоставляют виртуальные (логические) телефонные номера, которые заменяют физические линии классического телекоммуникационного оператора. VoIP-операторы могут предложить локальные номера в разных городах и странах, которые будут подключены к вашей АТС. Стоимость вызовов у таких операторов обычно ниже, чем у традиционных. Однако имейте ввиду, что для работы VoIP требуется определенная полоса пропускания вашего интернет-канала. 3CX поддерживает VoIP-транки с регистрацией (VoIP-транк регистрируется на сервере оператора, отправляя учетные данные авторизации) и VoIP-транки без регистрации, когда вызовы просто маршрутизируются оператором на публичный IP-адрес сервера 3CX.

Шаг 1: Требования для подключения VoIP-провайдеров / SIP-транков

  • Сетевой экран / маршрутизатор / NAT-устройство с поддержкой статической публикации портов и отключением SIP ALG. Если сетевые экраны используют динамическое преобразование портов, это может привести к проблемам, таким как односторонняя слышимость, отсутствие входящих вызовов и т.п. Также необходим статический IP-адрес сервера 3CX, т.к. при внезапном изменении адреса возможны проблемы с входящими вызовами. Для дополнительной информации о настройке сетевых экранов ознакомьтесь с главой Настройка маршрутизаторов и сетевых экранов.
  • Достаточная пропускная способность интернет-подключения. Поскольку VoIP-телефония - технология реального времени, повышенные требования предъявляются к качеству интернет-подключения. Каждый VoIP вызов занимает полосу примерно от 30 до 120 kbps, в зависимости от используемого голосового кодека. В статье Оценка полосы пропускания при DSL-подключении подробно рассматриваются параметры полосы пропускания в зависимости от используемых кодеков.

Шаг 2: Зарегистрируйте аккаунт у поддерживаемого VoIP-провайдера

Для начала работы необходим аккаунт у выбранного VoIP-провайдера. Желательно, чтобы он официально поддерживался системой 3CX. В этом случае 3CX предоставляет для него готовый шаблон конфигурации, который автоматически обновляется при изменениях в параметрах провайдера и ядра АТС.

Шаг 3: Протестируйте сетевой экран

3CX включает Мастер проверки сетевого экрана, которая проверяет корректность настройки сетевого экрана между сервером 3CX и оператором. Чтобы запустить проверку сетевого экрана из интерфейса 3CX:

  1. На главной странице интерфейса 3CX перейдите по ссылке “Firewall” и нажмите Run.”
  2. Убедитесь, что тест для SIP порта (5060 по умолчанию) и диапазона аудиопортов RTP (9000-9255) прошел успешно. В противном случае требуется проверка конфигурации сетевого экрана.

Внимание: 3CX не предоставляет техническую поддержку по настройке сетевых экранов. См. рекомендации по настройке распространенных сетевых экранов.

Шаг 4: Добавьте аккаунт VoIP-оператора в 3CX

После получения параметров аккаунта у VoIP-оператора, подключите его к 3CX:

  1. В интерфейсе управления 3CX выберите SIP Trunks” > Add SIP Trunk.”
  2. Выберите страну, в которой работает VoIP-оператор.
  3. Выберите вашего оператора из выпадающего списка. Если оператора нет в списке, выбирайте опцию “Generic” при выборе страны и “Generic VoIP Provider” или “Generic SIP Trunk” при выборе типа подключения. 3CX не гарантирует корректную работу АТС с такими операторами.
  4. Укажите основной номер SIP-транка (A-номер) или любой из DID-номеров, выданных оператором, который будет основным для этого транка. Нажмите OK”. SIP-транк будет создан, после чего откроется интерфейс настройки параметров транка.
  5. Укажите название транка (обычно это название оператора связи или направление, которое он обслуживает). Адрес SIP-сервера оператора Registrar/Server/Gateway Hostname or IP” и, возможно, адрес прокси-сервера оператора Outbound Proxy” уже будут заполнены из шаблона 3CX. Можно использовать опцию “Auto Discovery” для автоматического определения требуемых портов.
  6. Укажите количество одновременных вызовов Number of simultaneous calls”, которое вы или ваш провайдер разрешаете делать через этот транк.
  7. Если вы выбрали шаблон VoIP-оператора (VoIP provider), оставьте тип аутентификации Authentication” по умолчанию. Если тип аутентификации по умолчанию не подходит, укажите:
  • “Register/Account based” - укажите данные аутентификации транка - SIP ID и пароль.
  • “IP based” - аутентификация по внешнему IP-адресу сервера АТС. В этом случае SIP ID и пароль обычно не используются.
  • “Inbound only” and “Outbound only” - эти параметры у большинства операторов не используются.
  1. Укажите, как должны маршрутизироваться вызовы, поступающие на основной номер этого транка.
  2. Добавьте дополнительные номера транка (DID-номера). Перейдите на вкладку DIDs” и добавьте телефонные номера, присвоенные вам оператором, нажимая кнопку Add Single DID”. Добавляемые DID-номера по умолчанию направляют входящие вызовы на пользователя, определенного в АТС как Оператор. В дальнейшем вы можете добавить входящее правило для этого DID в разделе Inbound Rules” и направить входящие вызовы по нужному направлению.
  3. На вкладке “Caller ID” укажите номер, который будет показан внешним абонентам при исходящих вызовах через транк.
  4. На вкладке “Options” установите:
  • “Call options” - разрешить или запретить входящие / исходящие вызовы и отключить видеовызовы через этот транк.
  • “Advanced”:
  1. “Transport Protocol” - если ваш VoIP-оператор работает через протокол TLS (Transport Layer Security), установите опцию “TLS” и загрузите сертификат безопасности (.pem), предоставленный оператором. Будет включена безопасная связь через этот транк.
  2. “Alternative Proxy” - если ваш VoIP-оператор поддерживает резервный прокси-сервер, включите эту опцию и укажите адрес резервного прокси. Такая настройка упрощает подключение отказоустойчивых SIP-транков и DID-номеров, не требуя создания резервного транка.
  1. Для сохранения настроек нажмите OK”.

Шаг 5: Создайте исходящее правило для вызовов через транк

Исходящие правила указывают направление (SIP-транк или VoIP-шлюз), по которому должны маршрутизироваться исходящие вызовы. Направление выбирается в зависимости от того, какой пользователь или группа делают вызов; от набранного номера (префикса) или длины номера. Чтобы делать вызовы внешним абонентам через 3CX, необходимо создать хотя бы одно исходящее правило.

Чтобы в интерфейсе 3CX создать исходящее правило и указать, для каких вызовов его применить:

  1. В интерфейсе управления 3CX перейдите в “Outbound Rules”, нажмите “Add” и укажите название нового правила.
  2. В разделе “Apply this rule to these calls” укажите критерии, по которым это правило должно срабатывать:
  • Calls to numbers starting with prefix - применить правило для всех вызовов, начинающихся с указанных цифр. Например, префикс 9, включает правило для всех исходящих вызовов, номера которых начинаются с “9”.
  • Calls from extension(s) - применить правило для указанных добавочных номеров или диапазонов добавочных номеров. Укажите номера через запятую или блоками через тире, например, 100, 102-120.
  • Calls to Numbers with a length of - применить правило для номеров определенной длины. Например, длина 8, включает правило для всех локальных (городских) вызовов (с длиной номера 8 цифр). Теперь пользователям для звонков на городские номера не нужно набирать префикс.
  • Calls from extension group - применить правило для группы (или групп) добавочных номеров.
  1. “Make outbound calls on” - можно указать до пяти транков или шлюзов, по которым будет направлен вызов. Если первый в списке транк недоступен или занят, 3CX автоматически направляет вызов по альтернативным маршрутам. Будут последовательно выбраны все маршруты вплоть до удачного дозвона или достижения маршрута “Block Calls”.
  2. Номер, соответствующий исходящему правилу, можно модифицировать перед передачей SIP-оператору или на VoIP-шлюз. Для этого используются следующие параметры:
  • Strip digits - удалить одну или более цифр от начала номера. Например, можно удалить 1 цифру “9”, чтобы на шлюз передавался номер без префикса.
  • Prepend - добавить одну или более цифр к началу номера. Например, можно добавить префикс “2”, чтобы делать вызов с определенного порта шлюза.
  1. Нажмите “OK” чтобы сохранить исходящее правило.

Дополнительная информация

Магистраль SIP в Skype для бизнеса Server - Skype for Business Server 2015

  • Чтение занимает 10 мин

В этой статье

Узнайте о магистрали SIP в Skype для бизнеса Server Корпоративная голосовая связьLearn about SIP trunking in Skype for Business Server Enterprise Voice

С помощью протокола SIP инициируются и управляются сеансы связи по протоколу VoIP для базовой телефонной связи и для многих дополнительных коммуникационных услуг в режиме реального времени, таких как обмен мгновенными сообщениями, конференц-связь, обнаружение присутствия и мультимедиа.Session Initiation Protocol (SIP) is used to initiate and manage Voice over IP (VoIP) communications sessions for basic telephone service and for additional real-time communication services, such as instant messaging, conferencing, presence detection, and multimedia. В этом разделе предоставляются сведения по планированию для реализации каналов SIP, разновидности подключения SIP, которое распространяется за пределы локальной сети.This section provides planning information for implementing SIP trunks, a type of SIP connection that extends beyond the boundary of your local network.

Что такое распределение каналов SIP?What is SIP Trunking?

Распределение каналов SIP — это IP-подключение, которое устанавливает коммуникационную связь SIP между вашей организацией и поставщиком услуг Интернет-телефонии (ITSP) за пределами брандмауэра организации.A SIP trunk is an IP connection that establishes a SIP communications link between your organization and an Internet telephony service provider (ITSP) beyond your firewall. Как правило, магистраль SIP используется для подключения центрального сайта организации к ITSP.Typically, a SIP trunk is used to connect your organization's central site to an ITSP. В некоторых случаях вы также можете выбрать использование распределения каналов SIP для подключения к ITSP сайтов филиалов.In some cases, you may also opt to use SIP trunking to connect your branch site to an ITSP.

Развертывание магистрали SIP может стать большим шагом на пути к упрощению телекоммуникаций вашей организации и подготовке к усовершенствованиям к средствам связи в режиме реального времени.Deploying SIP trunking can be a big step toward simplifying your organization's telecommunications and preparing for up-to-date enhancements to real-time communications. Одним из главных преимуществ магистрали SIP является то, что вы можете консолидировать подключения вашей организации к сети общедоступных переключеных телефонов (PSTN) на центральном сайте, в отличие от его предшественника, магистрали мультиплексинга разделения времени (TDM), для чего обычно требуется отдельный магистраль от каждого сайта филиала.One of the primary advantages of SIP trunking is that you can consolidate your organization's connections to the public switched telephone network (PSTN) at a central site, as opposed to its predecessor, time division multiplexing (TDM) trunking, which typically requires a separate trunk from each branch site.

Экономия средствCost Savings

SIP-магистрали обеспечивают существенную экономию.The cost savings associated with SIP trunking can be substantial:

  • Междугородные вызовы обычно гораздо дешевле при использовании SIP-магистралей.Long distance calls typically cost much less through a SIP trunk.

  • Вы можете сократить расходы на управление и упростить развертывание.You can cut manageability costs and reduce the complexity of deployment.

  • Комиссий за интерфейсы BRI и PRI можно избежать, если подключить SIP-магистраль напрямую к поставщику услуг Интернет-телефонии по значительно меньшей цене. В устаревших TDM-магистралях вызовы тарифицировались поставщиками услуг на поминутной основе. Затраты на SIP-магистрали рассчитываются в зависимости от объема использования пропускной полосы канала, которую можно покупать небольшими порциями, что более экономично. Фактические расходы зависят от модели обслуживания, предложенной вашим поставщиком.Basic rate interface (BRI) and primary rate interface (PRI) fees can be eliminated if you connect a SIP trunk directly to your ITSP at significantly lower cost. In TDM trunking, service providers charge for calls by the minute. The cost of SIP trunking may be based on bandwidth usage, which you can buy in smaller, more economical increments. (The actual cost depends on the service model of the ITSP you choose.)

Сравнение SIP-магистралей и размещение шлюза ТСОП или IP-УАТСSIP Trunking vs. Hosting a PSTN Gateway or IP-PBX

Поскольку SIP-­магистрали напрямую подключаются к вашему поставщику услуг, вы можете устранить шлюзы ТСОП и избежать затрат на управление ими, а также упростить процедуру управления. Использование SIP-магистрали может обеспечить значительную экономию средств за счет упрощения процессов технического обслуживания и администрирования.Because SIP trunks connect directly to your service provider, you can eliminate your PSTN gateways and their management cost and complexity. Using a SIP trunk can lead to substantial cost savings through reduced maintenance and administration.

Расширенные услуги VoIPExpanded VoIP Services

Развертывание SIP-магистралей зачастую осуществляется ради функций голосовой, однако, поддержка голосовой связи — только первый этап.Voice features are often the primary motivation for deploying SIP trunking, but voice support is just the first step. С помощью магистрали SIP можно расширить возможности VoIP и включить Skype для бизнеса Server для предоставления более богатого набора служб.With SIP trunking, you can extend VoIP capabilities and enable Skype for Business Server to deliver a richer set of services. Например:For example:

  • Расширенное обнаружение присутствия для устройств, не работающих в Skype для бизнес-сервера, может обеспечить лучшую интеграцию с мобильными телефонами, что позволит вам видеть, когда пользователь находится на мобильном телефонном вызове.Enhanced presence detection for devices that are not running Skype for Business Server can provide better integration with mobile phones, enabling you to see when a user is on a mobile phone call.

  • Вызов экстренной помощи E9-1-1 позволяет властям, которые отвечают на 911 вызовов, определять местоположение звонившего с его или ее номера телефона.E9-1-1 emergency calling enables the authorities who answer 911 calls to determine the caller's location from his or her telephone number.

Примечание

обратитесь к поставщику услуг Интернет-телефонии для получения списка поддерживаемых и доступных услуг для вашей организации.Contact your ITSP for a list of services that they support and can enable for your organization.

Распределение каналов SIP по сравнению с прямыми подключениями SIPSIP Trunks vs. Direct SIP Connections

Термин канал пришел из технологии с коммутируемыми каналами.The term trunk is derived from circuit-switched technology. Он относится к выделенной физической линии, соединяющей телефонное коммутационное оборудование.It refers to a dedicated physical line that connects telephone switching equipment. Как и их предшественник, магистрали мультиплексинга разделения времени (TDM), магистрали SIP являются подключениями между двумя отдельными сетями SIP— предприятием Skype для бизнеса Server и ITSP.Like their predecessor, time division multiplexing (TDM) trunks, SIP trunks are connections between two separate SIP networks—the Skype for Business Server enterprise and the ITSP. В отличие от коммутируемых каналов, каналы SIP являются виртуальными подключениями, которые могут быть установлены в любых поддерживаемых типах подключений распределения каналов SIP.Unlike circuit-switched trunks, SIP trunks are virtual connections that can be established over any of the supported SIP trunking connection types.

С другой стороны, прямые подключения SIP — это подключения, которые не пересекают границы локальной сети (т.е. они подключаются к шлюзу ТСОП или УАТС во внутренней сети).Direct SIP connections, on the other hand, are SIP connections that do not cross the local network boundary (that is, they connect to a public switched telephone network (PSTN) gateway or private branch exchange (PBX) within your internal network). Сведения о том, как можно использовать прямые SIP-подключения к Skype для бизнеса Server, см. в материале Direct SIP connections in Skype for Business Server.For details about how you can use direct SIP connections with Skype for Business Server, see Direct SIP connections in Skype for Business Server.

Как реализовать магистраль SIP?How do I implement SIP Trunking?

Для реализации магистрали SIP необходимо маршрутировать подключение через сервер-посредник, который при необходимости выполняет функции прокси-сервера для сеансов связи между клиентами Skype для бизнеса Server и поставщиком услуг и транскодирует носители.To implement SIP trunking, you must route the connection through a Mediation Server, which acts as a proxy for communications sessions between Skype for Business Server clients and the service provider and transcodes media, when necessary.

Каждый сервер-посредник имеет внутренний сетевой интерфейс и внешний сетевой интерфейс.Each Mediation Server has an internal network interface and an external network interface. Внутренний интерфейс подключается к интерфейсным серверам.The internal interface connects to the Front End Servers. Внешний интерфейс обычно называется интерфейсом шлюза, так как он традиционно используется для подключения сервера-посредника к шлюзу открытой телефонной сети (PSTN) или IP-PBX.The external interface is commonly called the gateway interface because it has traditionally been used to connect the Mediation Server to a public switched telephone network (PSTN) gateway or an IP-PBX. Чтобы реализовать магистраль SIP, необходимо подключить внешний интерфейс сервера-посредника к внешнему краю компонента ITSP.To implement a SIP trunk, you connect the external interface of the Mediation Server to the external edge component of the ITSP. Внешний пограничный компонент ITSP может быть пограничным контроллером сеансов, маршрутизатором или шлюзом.The external edge component of the ITSP could be a Session Border Controller (SBC), a router, or a gateway.

Сведения о серверах-посредниках см. в материале Компонент сервера-посредника в Skype для бизнеса Server.For details about Mediation Servers, see Mediation Server component in Skype for Business Server.

Централизованные и распределенные SIP-магистралиCentralized vs. Distributed SIP Trunking

Централизованная магистраль SIP передает весь трафик VoIP, включая трафик веб-сайта филиала, через центральный сайт.Centralized SIP trunking routes all VoIP traffic, including branch site traffic, through your central site. Модель централизованного развертывания проста, экономически эффективна и, как правило, является рекомендуемой для реализации магистральных SIP-серверов с помощью Skype для бизнеса Server.The centralized deployment model is simple, cost-effective, and is generally the recommended approach for implementing SIP trunks with Skype for Business Server.

Распределенная магистраль SIP — это модель развертывания, в которой реализуются локальные магистрали SIP на одном или более филиалах.Distributed SIP trunking is a deployment model in which you implement local SIP trunks at one or more branch sites. Затем трафик VoIP будет перенаправлен с сайта филиала напрямую поставщику услуг, не проехав центральный сайт.VoIP traffic is then routed from the branch site directly to a service provider without going through the central site.

Распределенные SIP-магистрали требуются только в следующих случаях:Distributed SIP trunking is required only in the following cases:

  • Сайту филиала требуется безотказное телефонное подключение (например, на случай выхода из строя сети WAN).The branch site requires survivable phone connectivity (for example, if the WAN goes down). Это требование должно быть проанализировано для каждого сайта филиала; некоторые из ваших ветвей могут требовать избыточности и сбой, в то время как другие не могут.This requirement should be analyzed for each branch site; some of your branches may require redundancy and failover, whereas others may not.

  • Устойчивость требуется между двумя центральными сайтами.Resiliency is required between two central sites. Необходимо убедиться, что магистраль SIP прекращается на каждом центральном сайте.You need to make sure that a SIP trunk terminates at each central site. Например, если у вас есть центральные сайты Дублина и Туквилы, а для обоих используется только магистраль SIP одного сайта, если магистраль отстает, пользователи другого сайта не могут делать вызовы PSTN.For example, if you have Dublin and Tukwila central sites and both use only one site's SIP trunk, if the trunk goes down, the other site's users cannot make PSTN calls.

  • Сайт филиала и центральный сайт находятся в разных странах и регионах.The branch site and central site are in different countries/regions. По причинам обеспечения совместимости и по юридическим резонам требуется по крайней мере одна SIP-магистраль на страну или регион.For compatibility and legal reasons, you need at least one SIP trunk per country/region. Например, в Евросоюзе коммуникации не могут покинуть страну или регион не завершившись в централизованной точке.For example, in the European Union, communications cannot leave a country/region without terminating locally at a centralized point.

В зависимости от географического расположения сайтов и объемов трафика, который ожидается в вашем предприятии, может не потребоваться перенаправка всех пользователей через центральный магистраль SIP, или вы можете выбрать маршрут некоторых пользователей через магистраль SIP на сайте филиала.Depending on the geographical location of sites and how much traffic you anticipate within your enterprise, you may not want to route all users through the central SIP trunk, or you may opt to route some users through a SIP trunk at their branch site. Для анализа ваших потребностей, ответьте на следующие вопросы:To analyze your needs, answer the following questions:

  • Насколько велик каждый сайт (то есть, сколько пользователей включено для Корпоративная голосовая связь)?How big is each site (that is, how many users are enabled for Enterprise Voice)?

  • Сколько номеров прямого входного набора на каждом участке получает больше всего телефонных звонков?Which direct inward dialing (DID) numbers at each site get the most phone calls?

Принятие решения о развертывании централизованных или распределенных SIP-магистралей требует проведения функционально-стоимостного анализа.The decision whether to deploy centralized or distributed SIP trunking requires a cost-benefit analysis. В некоторых случаях лучше использовать распределенные магистрали, даже если это не является обязательным.In some cases, it may be advantageous to opt for the distributed deployment model even if it is not required. В полностью централизованном развертывании весь трафик сайтов филиалов маршрутизируется через каналы связи WAN.In a completely centralized deployment, all branch site traffic is routed over WAN links. Чтобы не оплачивать пропускную способность, необходимую для каналов связи WAN, вы можете предпочесть воспользоваться распространенным распределением каналов SIP.Instead of paying for the bandwidth required for WAN linking, you may want to use distributed SIP trunking. Например, вам может потребоваться развернуть сервер Standard Edition на сайте филиала с федерацией на центральном сайте или развернуть уцелевшие ветвные устройства или сервер ветвей с небольшим шлюзом.For example, you may want to deploy a Standard Edition server at a branch site with federation to the central site, or you may want to deploy a Survivable Branch Appliance or a Survivable Branch Server with a small gateway.

Поддерживаемые типы подключений SIP-магистралейSupported SIP Trunking Connection Types

Skype для бизнеса Server поддерживает следующие типы подключения для магистральных SIP:Skype for Business Server supports the following connection types for SIP trunking:

  • Технология мультипротокольной коммутации по меткам (MPLS) — это частная сеть, которая переносит и направляет данные из одного узла сети в следующий.Multiprotocol Label Switching (MPLS) is a private network that directs and carries data from one network node to the next. Пропускная способность в сети MPLS передается другим абонентам, и каждому пакету данных назначена метка, чтобы отличать данные одного абонента от данных другого.The bandwidth in an MPLS network is shared with other subscribers, and each data packet is assigned a label to distinguish one subscriber's data from another's. Для данного типа подключения виртуальная частная сеть (VPN) не требуется.This connection type does not require a virtual private network (VPN). Потенциальный недостаток — большое количество IP-трафика может сказаться на работе протокола VoIP, если последнему не дан приоритет.A potential drawback is that excessive IP traffic can interfere with VoIP operation unless VoIP traffic is given priority.

  • Частное подключение без другого трафика, например арендованное оптоволоконное подключение или линия T1 обычно является наиболее надежным и безопасным методом подключения. Данный тип обеспечивает самую высокую способность выдерживать нагрузку, но и является самым дорогим. VPN-сеть не требуется. Частные подключения подходят для организаций с большим объемом звонков или строгими требованиями к безопасности и доступности.A private connection with no other traffic—for example, a leased fiber-optic connection or T1 line—is typically the most reliable and secure connection type. This connection type provides the highest call-carrying capacity, but it is typically the most expensive. VPN is not required. Private connections are appropriate for organizations with high call volumes or stringent security and availability requirements.

  • Internet — наименее дорогой тип подключения, но и самый ненадежный.The Internet is the least expensive connection type, but it is also the least reliable. Подключение к Интернету — это единственный тип магистральных подключений Skype для бизнес-сервера SIP, который требует VPN.Internet connection is the only Skype for Business Server SIP trunking connection type that requires VPN.

Выбор типа подключенияSelecting a Connection Type

Наиболее подходящий для вашей организации тип подключения зависит от ваших потребностей и бюджета.The most appropriate SIP trunking connection type for your enterprise depends on your needs and your budget.

  • Для средних и больших предприятий MPLS-сеть обычно подходит лучше всего. Она обеспечивает необходимую полосу пропускания по меньшей цене, чем специализированная частная сеть.For a mid-size or larger enterprise, an MPLS network usually provides the greatest value. It can provide the necessary bandwidth at a cheaper rate than a specialized private network.

  • Для больших предприятий может потребовать отдельный оптоволоконный канал, линия T1, T3 или более высокого класса (E1, E3 или выше в Евросоюзе).Large enterprises may require a private fiber-optic, T1, T3 or higher connection (E1, E3 or higher in the European Union).

  • Для небольших предприятий и филиалов с низкой интенсивностью вызовов наилучшим вариантом может оказаться распределение каналов SIP через Интернет.For a small enterprise or branch site with low call volume, SIP trunking through the Internet may be the best choice. Данный тип подключения не рекомендуется для участков среднего и большого размера.This connection type is not recommended for mid-size or larger sites.

Требования к полосе пропусканияBandwidth Requirements

Требуемая полоса пропускания зависит от количества одновременных звонков, которая система должна быть способна обрабатывать. Следует учитывать доступность полосы для реализации в полной мере максимальной пропускной способности, за которую вы платите. Используйте следующую формулу для расчета требований к максимальной пропускной способности для SIP-магистрали:The amount of bandwidth your implementation requires depends on call capacity (the number of concurrent calls you must be able to support). You need to consider bandwidth availability, so that you can take full advantage of the peak capacity that you have paid for. Use the following formula to calculate SIP trunk peak bandwidth requirement:

Максимальная пропускная способность SIP-магистрали = Макс. кол-во одновременных звонков x (64 кбит + размер заголовка)SIP Trunk Peak Bandwidth = Max Simultaneous Calls x (64 kbps + header size)

Примечание

Размер заголовка максимум 20 байтHeader size is 20 bytes maximum.

Поддерживаемые кодекиCodec Support

Skype для бизнеса Server поддерживает только следующие кодеки:Skype for Business Server supports only the following codecs:

  • G.711 a-law (в основном используется за пределами Северной Америки)G.711 a-law (used primarily outside North America)

  • G.711 µ-law (используется в Северной Америке)G.711 µ-law (used in North America)

Оператор Интернет-телефонииInternet Telephony Service Provider

Реализация подключения SIP-магистрали к стороне оператора зависит от оператора.How you implement the service provider side of a SIP trunk connection varies from one ITSP to another. Для получения сведения о развертывания, свяжитесь с вашим оператором.For deployment information, contact your service provider. Список сертифицированных поставщиков магистральных служб SIP см. на сайте Microsoft Unified Communications Open Interoperability Program.For a list of certified SIP trunking service providers, see Microsoft Unified Communications Open Interoperability Program website.

Дополнительные. сведения о сертифицированных Майкрософтом операторах SIP-магистралей можно получить, связавшись с вашим представителем Майкрософт.For details about Microsoft certified SIP trunking providers, contact your Microsoft representative.

Важно!

Вам следует работать с сертифицированным оператором, чтобы обеспечить весь функционал SIP-магистрали (например, должны поддерживаться функции настройки и управления сессиями и всех расширенных служб VoIP). Техническая поддержка Майкрософт не распространяется на конфигурации, в которых используются услуги не сертифицированных операторов. Если в данный момент вы используете оператора Интернет-телефонии, не сертифицированного для SIP-магистралей, вы можете оставить его в качестве Интернет-оператора, и перейти к использования оператора для SIP-магистралей, сертифицированного Майкрософт.You must use a Microsoft certified service provider to ensure that your ITSP supports all of the functionality that traverses the SIP trunk (for example, setting up and managing sessions and supporting all of the extended VoIP services). Microsoft technical support does not extend to configurations that use noncertified providers. If you currently use an Internet service provider that is not certified for SIP trunking, you can opt to continue using that provider as your ISP and use a provider certified by Microsoft for SIP trunking.

Topologies and Components for SIP TrunkingTopologies and Components for SIP Trunking

На следующем рисунке показана топология магистральных магистральных SIP в Skype для бизнеса Server.The following figure depicts the SIP trunking topology in Skype for Business Server.

Топология распределения каналов SIPSIP trunking topology

Как показано на схеме, для подключений между корпоративной сетью и поставщиком услуг ТСОП используется виртуальная частная сеть VPN. Цель этой частной сети состоит в том, чтобы предоставить IP-подключение, повысить безопасность и (дополнительно) получить гарантированное качество обслуживания. По природе VPN нет необходимости использовать TLS для трафика SIP передачи сигналов или SRTP для трафика мультимедиа. Таким образом, подключения между предприятием и поставщиком услуг представляют обычные TCP-соединения для SIP и обычные RTP-соединения (через UDP) для туннелирования мультимедиа через IP VPN. Убедитесь, что все брандмауэры между маршрутизаторами VPN имеют открытые порты, чтобы разрешить маршрутизаторам VPN взаимодействие, и что IP-адреса на внешних границах маршрутизаторов VPN общедоступно маршрутизируемы.As shown in the diagram, an IP virtual private network (VPN) is used for connectivity between the enterprise network and the public switched telephone network (PSTN) service provider. The purpose of this private network is to provide IP connectivity, enhance security, and (optionally) obtain Quality of Service (QoS) guarantees. Because of the nature of a VPN, you do not need to use Transport Layer Security (TLS) for SIP signaling traffic or secure real-time transport protocol (SRTP) for the media traffic. Connections between the enterprise and the service provider therefore consist of plain TCP connections for SIP and plain real-time transport protocol (RTP) (over UDP) for media tunneled through an IP VPN. Ensure that all firewalls between the VPN routers have ports open to allow the VPN routers to communicate, and that the IP addresses on the external edges of the VPN routers are publicly routable.

Важно!

Обратитесь к вашему поставщику услуг, чтобы узнать, обеспечивает ли он поддержку высокого уровня доступности, включая отработку отказа.Contact your service provider to determine whether it provides support for high availability, including failover. Если обеспечивает, то необходимо определить процедуры для ее настройки.If so, you will need to determine the procedures for setting it up. Например, нужно ли настроить только один IP-адрес и один магистраль SIP на каждом сервере-посреднике или настроить несколько магистральных SIP на каждом сервере-посреднике?For example, do you need to configure only one IP address and one SIP trunk on each Mediation Server, or do you need to configure multiple SIP trunks on each Mediation Server? > Если у вас несколько центральных сайтов, также спросите, имеет ли поставщик услуг возможность включить подключения к другому центральному сайту и с него.> If you have multiple central sites, also ask whether the service provider has the ability to enable connections to and from another central site.

Примечание

Для магистральных SIP настоятельно рекомендуется развернуть автономные серверы-посредники.For SIP trunking, we strongly recommend that you deploy stand-alone Mediation Servers. Дополнительные сведения см. в разделе Deploying Mediation Servers and Defining Peers документации по развертыванию.For details, see Deploying Mediation Servers and Defining Peers in the Deployment documentation.

Защита сервера-посредника для распределения каналов SIPSecuring the Mediation Server for SIP Trunking

В целях безопасности необходимо настроить виртуальную локальную сеть (VLAN) для каждого соединения между двумя маршрутизаторами VPN. Фактический процесс настройки VLAN зависит от производителя маршрутизатора. Подробные сведения следует запросить у вашего поставщика маршрутизатора.For security purposes, you should set up a virtual LAN (VLAN) for each connection between the two VPN routers. The actual process for setting up a VLAN varies from one router manufacturer to another. For details, contact your router vendor.

Рекомендуется придерживаться следующих правил.We recommend that you follow these guidelines:

  • Настройка виртуальной локальной сети (VLAN) между сервером-посредником и маршрутизатором VPN в сети периметра (также известной как DMZ, демилитаризованная зона и экранизированная подсеть).Set up a virtual LAN (VLAN) between the Mediation Server and the VPN router in the perimeter network (also known as DMZ, demilitarized zone, and screened subnet).

  • Не разрешать передачу широковещательных или многоадресных пакетов от маршрутизатора в VLAN.Do not allow broadcast or multicast packets to be transferred from the router to the VLAN.

  • Блокировать любые правила маршрутивки, которые маршрутируют трафик от маршрутизатора до любого места, кроме сервера-посредника.Block any routing rules that route traffic from the router to anywhere but the Mediation Server.

Если используется VPN-сервер, рекомендуется придерживаться следующих правил.If you use a VPN server, we recommend that you follow these guidelines:

  • Настройка VLAN между VPN-сервером и сервером-посредником.Set up a VLAN between the VPN server and the Mediation Server.

  • Не разрешать передачу широковещательных или многоадресных пакетов от VPN-сервера в VLAN.Do not allow broadcast or multicast packets to be transmitted from the VPN server to the VLAN.

  • Заблокировать любое правило маршрутиации, которое передает трафик VPN-сервера в любую точку, кроме сервера-посредника.Block any routing rule that routes VPN server traffic to anywhere but the Mediation Server.

  • Шифровать данные в VPN с помощью протокола GRE (generic routing encapsulation).Encrypt data on the VPN by using generic routing encapsulation (GRE).

См. такжеSee also

Магистраль SIP-узла филиала в Skype для бизнеса ServerBranch site SIP trunking in Skype for Business Server

Провод СИП-4 4х16: технические характеристики, диаметр, мощность

Современную жизнь невозможно представить без таких бытовых приборов, как утюг, чайник, микроволновая печи или холодильник. Все эти устройства работают от электричества, получаемого, в свою очередь, из ЛЭП установок, в которых используется СИП кабель. В этой статье говорится о том, что такое СИП-4, описываются его основные технические характеристики, а также представлены основные ошибки и проблемы при эксплуатации провода.

Как расшифровывается кабель СИП-4 4х16

Изделие СИП-4 4х16 – это провод самонесущего типа, имеет четырехжильную структуру проводников с площадью по 16 мм2 на каждую жилу.

В роли основной изоляции применяется светостабилизиронный сшитый ПВХ материал. Такой провод очень часто используется при монтаже и подключении линий электропередач. Провод получил большое распространение, благодаря своим многочисленным техническим параметрам. Чаще всего, его используют при подключении отдельных потребителей, зданий и промышленных объектов.

Внешний вид изделия

Преимущества СИП кабеля:

  • Долгий срок службы;
  • Выдерживает экстремальные температурным условиям;
  • Устойчивость к механическим повреждениям.
Виды самонесущих проводов

Расшифровка СИП-4 4х16 выглядит следующим образом:

  • СИП – самонесущий изолированный провод;
  • 4 – категория кабеля;
  • 4 – четыре жилы внутри для перемещения тока;
  • 16 – площадь сечения каждой жилы в мм2.

Важно! Также, в зависимости от конструкции и области применения, изделие может иметь дополнительную защиту в виде бронированного слоя. Подобный провод допускается прокладывать под землей в кабель-каналах или кабельной канализации.

Далее в статье указана информация о проводе СИП 4 4х16, его технических характеристиках и правила прокладки изделия.

Технические характеристики провода СИП-4 4х16 (+ диаметр, мощность)

Кабель имеет следующие заводские параметры:

  • Допустимая мощность 0.6/1кВ;
  • Температурный диапазон от -50 до 50 градусов;
  • Минимальная температура монтажа провода без предварительного прогрева -15°С;
  • Предельно допустимая температура при эксплуатации – 85 градусов;
  • Критическая токовая температура для перегрева провода 120 градусов;
  • Минимально разрешенный радиус загиба провода при монтаже – 7 наружных диаметров;
  • Срок эксплуатации до 30 лет;
  • Гарантия до 3 лет.

Внимание! Полный список характеристик можно найти в спецификации изделия.

СИП 4 16 характеристики

Сфера применения кабеля СИП-4 4х16

Выше было уже сказано, что такой провод очень часто применяется при монтаже ЛЭП, и его часто можно заметить на столбах ВЛ. Также, это изделие используется для образования линейных ветвей от магистральных линий электропередач при устройстве вводов к различным объектам.

СИП провод можно протянуть самостоятельно к столбам и получать бесперебойное электричество, но при этом необходимо получить специальное разрешение в сетевой организации.

Конструкция кабеля СИП-4 4х16

Внутри изделия находится кабельный сердечник, который выполняет функцию проводника. Он производится из алюминиевого сплава в соответствии с ГОСТ No52373-2004. Жилы кабеля могут иметь секторный или круглый вид, состоят из определенного количества проволок, которые скручиваются в плотный жгут.

ЛЭП установки

Внутренние жилы также производятся из алюминия, иногда в составе используется медь. Внешняя изоляция изготавливается из ПВХ материалов. Эта оболочка может быть горючей или не горючей. Чаще используют первый вариант, что обеспечивает дополнительную безопасность эксплуатации ЛЭП.

Правила выбора провода СИП-4 4х16

Для того, чтобы правильно выбрать провод, необходимо рассчитать его сечение. Очень тонкие кабели будут иметь достаточно высокое сопротивление, в следствие чего провода начнут перегреваться, а при слишком высокой температуре случится короткое замыкание или пожар.

Важно! Существуют специальные таблицы, где прописаны правила подбора подходящих сечений под определенное напряжение.

Также, при выборе СИП-4 необходимо определить изоляционный слой провода. Для территории с высокой интенсивностью солнечных лучей, желательно покупать провода с оболочкой из светостабилизированного полиэтилена.

Правильное крепление к столбу

При риске резкого внешнего перегрева, необходимо отдать предпочтение негорючей оболочке. Если кабель прокладывается в местах значительных перепадов температур, желательно выбирать изделия с термопластичной изоляцией.

Важно! При выборе необходимо произвести визуальный осмотр изделия. Если целостность упаковки нарушена, то такой кабель приобретать не стоит. Также, можно запросить сертификат соответствия, где указан завод-изготовитель, дата производства изделия и его полное наименование. Если такого документа нет, то, возможно, это подделка. Перед покупкой необходимо изучить самые популярные фабрики и искать именно их продукцию.

Правила монтажа СИП-4 4х16

Первым делом, прокладываются кабельные пути, после чего необходимо подключить сеть питания, которая будет источником энергии для помещений.

Процесс монтажа

Необходимо помнить о том, что соединение с кабелем без слоя изоляции выполняется через гофры с герметичным составом, а также, с применением фиксаторов. В этом случае нужно зачистить край провода, а потом сжать его прессом. Допускается использование ответвительных фиксаторов, необходимых для проводов без несущей жилы.

Ошибки, возникающие в процессе прокладки

Проблема №1. Раскатка провода по грунту.

При монтаже необходимо внимательно раскладывать изделие, чтобы не повредить внешнюю изоляцию. Для этого существуют специальные ролики и опоры, на которые можно повесить провод. Поврежденный внешний слой может привести к снижению срока эксплуатации и КЗ.

Раскатка на опорах

Проблема №2. Повторное применение фиксаторов.

Такие фиксаторы применяются для ветвления провода от магистрали к абоненту. Использование прокалывающих фиксаторов, помогает выполнить это действие без снятия внешнего слоя, но повторное их применение не разрешается.

Проблема №3. Скручивание провода.

Запрещено скручивать в общую жилу два и более проводов СИП, так как, в соответствии с ПУЭ, каждое изделие подключается отдельно.

Проблема №4. Два анкерных фиксатора на один кронштейн.

Для одного кронштейна устанавливается всего один фиксатор. Это правило необходимо запомнить для того, чтобы качественно выполнить прокладку.

Проблема №5. Не проводился визуальный осмотр.

При неправильно хранении провода на складе, он теряет свои свойства. Если при покупке человек не обратил внимания на мелкие царапины или трещины, то впоследствии это может привести не только к снижению срока службы, но и к возникновению опасных ситуаций. Перед непосредственной прокладкой необходимо осмотреть провод несколько раз.

Проблема №6. Не используется дополнительная защита.

Для этого можно применять специальные гофры, которые предотвращают возникновение пожара или обледенения изделий. Если на кабеле скопится лед, то он начнет провисать, что в итоге приведёт к его обрыву.

Правила хранения и транспортировки СИП-4 4х16

Как и любая кабельная продукция, СИП провода необходимо хранить в сухом складском помещении, иначе существует риск возникновения плесени.

Хранение кабеля на складе

Барабаны с проводом должны стоять на кантах, а не лежать на боку. Это может повредить внешний слой изоляции. Допускается хранение на открытом воздухе, но вдали от прямых солнечных лучей. Время от времени нужно проверять целостность упаковки и провода, потому что, если на складе есть грызуны, они способны испортить внешнюю оболочку.

Перевозить катушки с проводами необходимо только в специальном погрузчике. Барабаны нужно закреплять, чтобы при транспортировке они не катались по кузову. Погрузочно-разгрузочные работы осуществляются с использованием специальной техники.

Внимание!  Размещение катушек с проводами на земле без дополнительных опор не допускается. Пренебрежение этим правилом может привести к механическим повреждениям внешней оболочки, из-за чего жилы начнут перегреваться и случится короткое замыкание.

Транспортировка изделий

Производители провода СИП-4 4х16

На современном рынке кабельной продукции в данное время достаточно большая конкуренция. Электромонтеры советуют отдавать предпочтение фабрикам с опытом работы более 10 лет. Также, перед покупкой можно прочитать отзывы о производителе или просмотреть их сайт в интернете. Если у человека нет опыта в покупке таких изделий, то ему следует обратиться за помощью к профессионалам. Помимо технических параметров, нужно уметь провести визуальный осмотр провода. Ниже представлены одни из самых популярных заводов по состоянию на начало 2020 года.

ТОО «KAZ TEL», Шымкент

Предприятие начало свою работу в 2010 году. За 10 лет завод стремительно развивался и расширял свои территории. В наличии имеется более 1000 типоразмеров изделий, а заказ можно сделать прямо на сайте компании. Логисты занимаются доставками по Европе и России. На заводе функционирует собственный испытательный центр, поэтому вся продукция проходит жесткий отбор. Предприятие работает по импортной технологии изготовления, активно сотрудничая с коллегами из Германии.

ООО «Завод Агрокабель», Великий Новгород

Предприятие начало функционировать с 1989 года, и в настоящее время оно сотрудничает со многими странами Европы и Азии. Продукция изготавливается на высокопрофессиональном оборудовании. На данный момент завод занимается разработкой нового вида проводов с функцией устойчивости к высоким температурам. В наличии имеется более 5000 тысяч типоразмеров изделий. Можно заказать продукцию прямо с сайта, так как в наличии имеется полный ассортимент продукции.

Процесс производства провода

ООО «АлтайКабель», Барнаул

Компания начала свою работу в 1990 году. На сегодняшний день в наличии имеется более 20000 тысяч типов изделий. Руководители занимаются перевозками продукции по воздуху и железнодорожным путям. Технологи могут изготовить изделие по индивидуальному заказу. Одни из немногих кто выпускает провода с устойчивостью от грибка и грызунов. Имеют много положительных отзывов как на сайте, так и на просторах интернета. Завод является одним из десяти лидирующих предприятий на территории России. Постоянно выпускаются новые провода с различными функциями устойчивости от повреждений и более продолжительным сроком службы.

Перед покупкой изделий мастера рекомендуют выбрать несколько подходящих фабрик и узнать о них больше на тематических форумах, так как многие отзывы могут быть сфальсифицированы.

Виды сечения

В заключении необходимо отметить, что без провода СИП-4 невозможно было бы получать бытовое электричество и передавать его потребителям. Изделие уже давно зарекомендовало себя на рынке не только высокими качествами, но и доступной ценой. Для того, чтобы правильно выбрать кабель, необходимо получить о нем как можно больше информации, рассчитать сечение и нагрузку, а также пропускную способность проводника.

Какой тип кодека лучше всего совместим с SIP для Android



Я хочу разработать приложение Android, которое будет использовать SIP-сервер моего клиента. Мой клиент выставляет пару REST API с сервера SIP для связи с приложениями.

Я хочу знать, какой тип кодека будет лучшим для этого приложения?

В принципе, я хочу создать SIP-стек и отправить SIP-пакеты на сервер . Таким образом, должна существовать система кодирования и декодирования пакетов. Мой клиент предпочитает 16 Кб / сек, но я не уверен, что мне следует использовать.

android rest voip sip sip-server
Поделиться Источник Foyzul Karim     31 марта 2011 в 13:10

5 ответов


  • Работа с SIP и VOIP

    Как лучше всего начать с SIP и VOIP , кроме SIPdemo и SIPdroid в android? Пожалуйста, предложите какой-нибудь хороший учебник по этому вопросу.

  • Какой тип сервера лучше всего использовать для Android?

    Я создаю приложение, которое сохраняет заметки, и хотел бы, чтобы оно могло синхронизироваться с настольным приложением PC. Мне интересно, какой тип сервера лучше всего использовать и как я буду сохранять и извлекать данные с сервера? Все данные будут строками или массивом строк.



11

Как уже говорили другие, SIP не передает аудио или видео. Хотя теоретически вы можете передавать данные по любому транспорту, включая ATM, аналоговые линии, DS0 и т. д., в реальном мире RTP является наиболее распространенным. RTP (протокол реального времени) и RTCP (протокол управления в реальном времени) или SRTP (Безопасный RTP) обычно несут аудио и видео.

Что касается кодеков, то вы будете ограничены тем, что поддерживает ваш сервер. Вот несколько распространенных кодеков и некоторые плюсы и минусы каждого из них.

G.711-платное качество (то есть хорошее, как хорошая аналоговая телефонная линия, или даже немного лучше). "Universal" в том смысле, что практически каждое устройство поддерживает G.711. Занимает много полосы пропускания, на самом деле он не сжимает данные (G.711-это "compander"). Базовая линия G.711 довольно голая (на самом деле это пара поисковых таблиц). Добавление I добавление потеря пакетов сокрытие (PLC) и приложение № II добавляет молчания подавления и генерации комфортного шума.

GSM-используется на мобильных телефонах, звучит нормально, хорошо PLC, хорошее сжатие

G.729A-широко используется, почти платное качество, хорошее сжатие (8 кбит / с)

G.723.1-широко используется, почти так же хорошо, как G.729, лучшее сжатие (4-5Kbps)

G.722-звучит лучше, чем G.711, широкополосный (в два раза больше полосы пропускания звука G.711 или аналогового вызова), та же полоса пропускания, используемая на линии, что и G.711

GIPS-существуют различные импликации, одна свободна. IIRC, использует около 13.5Kbps на линии, звук не так хорош asG.723.1 (но это перцептивная метрика, YMMV) занимает много процессора.

Все кодеки используют некоторый процессор и другие системные ресурсы, как правило, чем агрессивнее кодек (чем меньше пропускная способность), тем больше используется процессор. Кроме того, все эти конкретные кодеки являются кодеками с потерями-они теряют некоторые данные. Это означает, что существует сжатие, а не то, что части звука отбрасываются из-за плохой маршрутизации и плохого качества линии. Так же, как MP3 считается кодеком LOSSY, в то время как FLAC считается без потерь. Если вам интересно, следующая статья Википедии объясняет более подробно: http://en.wikipedia.org/wiki/ Lossy_compression

Поделиться Hank Karl     01 апреля 2011 в 13:09



4

Вам нужно знать, какие кодеки и протоколы будет поддерживать этот сервер SIP. Если вы контролируете оба конца и хотите придерживаться 16 кбит / с, вам понадобится iLBC (без роялти) или G.729 (применяются роялти). G.711 и (теперь) G.722 также не имеют роялти, но оба используют ~64Kbps.

Приведенный выше список хорош, но есть несколько проблем.:

GIPS-существуют различные импликации, одна свободна. IIRC, использует около 13.5Kbps на линии, звук не так хорош asG.723.1 (но это перцептивная метрика, YMMV) Требуется много процессора.

GIPS-это не кодек-iLBC и iSAC - это кодеки, разработанные GIPS. с регистрацией или входом свободный и стандартизированный. iLBC отличается высоким качеством, 13 или 15 кбит / с, и очень устойчив к потере пакетов по сравнению с G.729 или даже G.711. Вы можете иметь 30 или даже 50% потерь с iLBC и все равно быть понятым. Я не уверен, что сказал бы, что он использует много CPU по сравнению с G.729.

Все кодеки используют некоторый процессор и другие системные ресурсы, как правило, чем агрессивнее кодек (чем меньше пропускная способность), тем больше используется процессор. Кроме того, все кодеки являются кодеками с потерями-они теряют часть данных.

Ну, G.711 на самом деле не является потерями per-se (теоретически да, но это почти больше потери на уровне квантования). 64K G.722 тоже не очень потеряно. G.723 высасывает мертвых песчанок через садовые шланги. 🙂

Поделиться jesup     07 апреля 2011 в 20:59



1

Это звучит как плохая идея сделать это самостоятельно. Разработка sip-клиента не является тривиальной задачей, поскольку существует несколько протоколов, которые вам придется реализовать. Выбор кодировки-не очень важное решение по сравнению с rest.

imho вы должны использовать один из доступных SIP-стеков с открытым исходным кодом (например, pjsip) или построить свое приложение поверх sip-клиента с открытым исходным кодом (например, sipdroid).

Но раз уж вы попросили кодек: используйте кодек GSM. Сохраненная пропускная способность и звуки OK. G.711 в противном случае является стандартным кодеком, который поддерживает 99% всех sip-серверов.

Поделиться jgauffin     31 марта 2011 в 13:27


  • Какой монадический тип лучше всего подходит для объяснения класса монад?

    Какой монадический тип лучше всего подходит для объяснения класса монад некоторым людям, которые ничего не знают о monads? Должен ли я использовать что-то из библиотеки standart Haskell или мне следует создать какой-то новый тип?

  • SIP SDK для android с поддержкой кодека G729

    Мне нужно добавить некоторые базовые функции SIP в мое приложение. Мне нужно, чтобы он мог подключаться к моему серверу asterisk и совершать аудиовызовы SIP с помощью кодека G729. К сожалению, по умолчанию android SIP api не поддерживает кодек G729 (насколько я знаю), поэтому я не могу его...



0

- Есть?

SIP не отправляет и не обрабатывает пакеты данных ANY. SIP-это протокол инициации сеанса, и он обрабатывает согласование сеансов.

Затем сеансы arae - в случае auio и видео-основаны на RTP и используют RTSP для сигнализации. Таким образом, ваш вопрос указывает на отсутствие REAL знаний о том, что вам нужно сделать - реальное предположение таково: вам нужен кодек, совместимый с RTP.

Что тоже бессмысленно. RTP является просто носителем протокола. THis - это все равно что спрашивать "what is a HTTP compatioble image format". HTTP все равно. Браузер делает это.

В случае RTP это означает-RTP все равно. Он может передавать данные ANY. WHat важно то, что обе стороны знают один и тот же кодек. Итак, в вашем случае это означает:

  • Если вы программируете обе стороны, то это ваш выбор.
  • Если вы программируете только один sidwe (например, телефонную систему SIP), то вопрос в том, как обрабатываются программы "normal".

Поделиться TomTom     31 марта 2011 в 13:34



0

Есть две вещи, которые вы должны принять во внимание здесь:

  • Какие другие устройства/серверы, которые обрабатывают media, развертываются или планируются к развертыванию
  • Ваш клиент ищет узкополосное или Широкополосное решение - это сильно повлияет на качество голосовой связи

После того, как вы прибили ответы на два вопроса выше, вы сможете выбрать. Для мобильных устройств обычно используются голосовые кодеки AMR-NB или AMR-WB. Для SIP это обычно G.729 или G.722.x. У вас также есть Speex, ISAC и SILK на выбор. Вам, вероятно, нужно будет сделать G.711 в любом случае, просто чтобы взаимодействовать со всем - пропускная способность будет выше, хотя.

Здесь нет простого ответа. Если ваш клиент может выбрать или указать, какие другие устройства используются - вам будет легче выбрать.

Поделиться Tsahi Levent-Levi     28 октября 2011 в 05:06


Похожие вопросы:


Как сделать приложение Android VOIP с помощью REST на основе API SIP-сервера

Я совершенно новичок в области VOIP. У моего клиента есть API , который основан на REST . Моя задача-создать приложение Android, которое позволит пользователю звонить с помощью WiFi или сотовой сети...


Какой тип столбца лучше всего подходит для URL?

Какой тип столбца лучше всего подходит для поля URL для SQL Server? Тип: VARCHAR или NVARCHAR? Длина ? Аналогичный вопрос для MySQL .


Какой тип данных лучше всего использовать для денег в C#?

Какой тип данных лучше всего использовать для денег в C#?


Работа с SIP и VOIP

Как лучше всего начать с SIP и VOIP , кроме SIPdemo и SIPdroid в android? Пожалуйста, предложите какой-нибудь хороший учебник по этому вопросу.


Какой тип сервера лучше всего использовать для Android?

Я создаю приложение, которое сохраняет заметки, и хотел бы, чтобы оно могло синхронизироваться с настольным приложением PC. Мне интересно, какой тип сервера лучше всего использовать и как я буду...


Какой монадический тип лучше всего подходит для объяснения класса монад?

Какой монадический тип лучше всего подходит для объяснения класса монад некоторым людям, которые ничего не знают о monads? Должен ли я использовать что-то из библиотеки standart Haskell или мне...


SIP SDK для android с поддержкой кодека G729

Мне нужно добавить некоторые базовые функции SIP в мое приложение. Мне нужно, чтобы он мог подключаться к моему серверу asterisk и совершать аудиовызовы SIP с помощью кодека G729. К сожалению, по...


Какой стек SIP выбрать для приложения с закрытым исходным кодом в Android

Мне нужно сделать голосовые и видеозвонки с помощью SIP. Я не знаю, какой SIP-стек выбрать, потому что приложение должно быть закрытым, но все неплохие стеки распространяются под лицензией GPL. Я...


Какой фреймворк Material Design лучше всего подходит для Phonegap Android?

я решил использовать один из материальных фреймворков в своем следующем проекте Cordova Phonegap. но я не знаю, какой из них лучше всего подходит для phonegap и отлично работает в более старых...


Согласование кодека в SIP invite

Я настроил свои управляющие и принимающие конечные точки sip с помощью кодеков PCMA, PCMU и G729A соответственно. Когда я вижу SIP-приглашение с движущей стороны, я вижу кодеки в том же порядке....

Этот стервятник пролетел 1000 миль в рекордном полете над Африкой

Африканский стервятник с белой спиной, с размахом крыльев семь футов, крючковатым клювом и пристальным взглядом черных глаз, производит впечатление внушительного вида.

Возможно, неудивительно, что эти находящиеся под угрозой исчезновения хищные птицы заработали гораздо меньше долларов на охрану, чем слоны и тигры. Наука тоже отстала. (Прочтите, почему нам нужно спасать «отвратительных» стервятников.)

Корин Кендалл пытается это изменить.

Грантополучатель Национального географического общества начал раздвигать завесу над этой очаровательной птицей. Недавно она обнаружила, что один стервятник пролетел более 1100 миль от места своего рождения в Танзании в Южную Африку, а затем вернулся в Зимбабве всего за три месяца. (Двух- или трехлетний мужчина по прозвищу Свуп даже сделал пит-стоп на алмазном руднике Ботсваны.)

Передатчик Свупа находится на его спине, так что он не повлияет на его способность летать, позволяя устройству летать. получить достаточно света для зарядки солнечных батарей.

Фотография Коринн Дж. Кендалл

Пожалуйста, соблюдайте авторские права. Несанкционированное использование запрещено.

«Если посмотреть не только на стервятников, но и на любое наземное животное, похоже, что это может быть одно из самых длительных расселений, когда-либо обнаруженных», - говорит Кендалл, который также является помощником куратора по сохранению и исследованиям в зоопарке Северной Каролины.

Крылья, будут путешествовать

Множество наземных животных совершают дальние миграции - вспомните бабочек-монархов в Северной Америке и антилоп гну в Серенгети, - но расселения представляют собой другое поведение, потому что животные не возвращаются.

Многие виды стервятников разбегаются от места своего рождения в поисках пищи или помощников, постоянно оседая на новом месте, хотя немногие в конечном итоге доходят до Свупа.

Зоопарк Северной Каролины и Общество охраны дикой природы с 2015 года отслеживали 12 стервятников с белой спиной. Спутниковые метки на солнечной энергии, частично финансируемые Национальным географическим обществом, показывают, что большинство этих птиц оставались более или менее близко к дому.

В то время как некоторые из участников исследования продолжали передавать данные о перемещениях в течение двух лет, три помеченных стервятника умерли довольно быстро, вероятно, из-за отравленных туш.

Вот что происходит, когда вы помещаете камеру в тушу антилоп гну на Серенгети, а затем уезжаете.

«Если корову убили львы или гиены, люди выйдут и окропят тушу пестицидами, а затем эти хищники могут вернуться и отравиться», - говорит она. (По теме: «Львы, гиена, убитая отравленным мясом».)

Год птицы

В 1918 году Конгресс принял Закон о перелетных птицах, чтобы защитить птиц от бессмысленного убийства.Чтобы отпраздновать столетнюю годовщину, National Geographic в партнерстве с Национальным обществом Одюбон, BirdLife International и Корнельской лабораторией орнитологии объявил 2018 год Годом птицы. Подпишите обещание, чтобы узнать о действиях этого месяца и поделиться своими действиями с помощью #BirdYourWorld, чтобы усилить свое влияние.

Но Свуп по-прежнему проигрывает - по состоянию на 1 февраля Кендалл сообщает, что он все еще жив и здоров, перемещаясь взад и вперед по границе между Южной Африкой, Ботсваной и Зимбабве.

Расширяя границы

«Стервятники продолжают очаровывать меня, потому что они просто расширяют границы», - говорит Керри Уолтер, основатель южноафриканской организации по сохранению стервятников VulPro. «Как только мы думаем, что что-то знаем, другая птица показывает нам иначе». (Узнайте, почему исчезают многие африканские стервятники.)

Свуп все еще жив и здоров по состоянию на 1 февраля.

Фотография Корин Дж. Кендалл

Пожалуйста, соблюдайте авторские права.Несанкционированное использование запрещено.

Вольтер следил за перемещениями двух других африканских видов, мысовского стервятника и белоголового стервятника, и обнаружил, что эти животные, похоже, также ходят на большие расстояния.

Один белоголовый стервятник, выпущенный ею в Южной Африке, прислал свои последние координаты из Анголы и, похоже, направлялся в Демократическую Республику Конго, когда сигнал пропал.

И Уолтер, и Кендалл обеспокоены тем, что такие находки усложняют перспективы сохранения стервятников, потому что нельзя просто создать охраняемую территорию и ожидать, что птицы останутся на месте.

Полезные птицы

И это не просто плохие новости для птиц, это плохие новости для нас. Падальщики являются важными переработчиками экосистемы и даже могут нейтрализовать смертельные микробы.

Поскольку стервятники поедают мертвых травоядных, таких как бегемоты, их желудочная кислота убивает бактерии сибирской язвы, которые могли быть естественным образом съедены животным, пока оно было живым. Пропитанные сибирской язвой туши опасны для людей, потому что употребление в пищу зараженного мяса может быть смертельным.

Ученые прикрепляют передатчики к стервятникам с помощью самодельного рюкзака, который проходит под ногами стервятника.

Фотография Коринн Дж. Кендалл

Пожалуйста, соблюдайте авторские права. Несанкционированное использование запрещено.

«Мы считаем, что стервятники уменьшают распространение сибирской язвы, поскольку они могут потреблять болезнь, не заражаясь», - говорит Кендалл. (Посмотрите, каково это быть обедом для стервятника.)

В 2017 году помеченные стервятники Кендалл и его коллеги дали еще более практическую цель: птицы помогли направить персонал в национальных парках Танзании к трупам бегемотов во время недавней вспышки сибирской язвы.Это позволило персоналу уничтожить трупы до того, как бактерии смогут распространиться.

«Люди склонны думать о них как о некрасивых птицах, - говорит Кендалл, - но они действительно невероятные».

Защитная роль микробиомов лица и кишечника стервятников способствует адаптации к мусору

Предпосылки

Стервятники - падальщики, чьи глобальные популяции находятся под серьезной угрозой, и необходимо более глубокое понимание различных аспектов их биологии [1,2].Стервятники известны как природные уборщики, поскольку они питаются мышцами и внутренностями туш животных, умерших в основном от недоедания, несчастных случаев, естественных или инфекционных заболеваний, поэтому ожидается, что они несут патогены, вызывающие сибирскую язву, туберкулез, бруцеллез. и др. [3]. Туши - очень богатый питательными веществами ресурс, и было высказано предположение, что выброс токсинов и генов патогенности в микробиом туши является частью микробной стратегии по борьбе с другими микробами [4,5].Основными колонизаторами туши являются микробы, происходящие из нормальной флоры мертвого животного, которые могут стать патогенными в окружающей среде туши [6], а также бактерии, обитающие в почве, нематоды, грибы и насекомые [7]. Несмотря на потенциально серьезные последствия для здоровья, связанные с их употреблением, патогенный репертуар кишечника этих видов птиц не был полностью охарактеризован с точки зрения их возможного воздействия на окружающую среду. Таким образом, одним из самых интригующих аспектов биологии стервятников является то, как они защищают себя от проблем со здоровьем, создаваемых их пищевым источником.Физиологический, генетический и геномный анализы различных видов стервятников исследовали этот аспект и идентифицировали гены, связанные с дыханием, иммунитетом и желудочной секрецией, в качестве кандидатов на адаптацию к его питательной диете [8,9].

С геномной революцией стало очевидно, что помимо геномных изменений, микробиота, связанная с хозяином, играет важную роль в специализации рациона позвоночных [10] и что микробиом кишечника может играть очень важную, но неизученную роль в обусловленном диетой видообразовании [11]. ].Микробиом кишечника связан с особенностями пищеварения, такими как сбор энергии, усвоение питательных веществ и гомеостаз кишечника [12], среди других фенотипов, связанных с иммунной и нейроэндокринной системами [13-15]. Кроме того, также была продемонстрирована роль микробиома в защите здоровья хозяина [16,17], а его нарушения приводят к таким заболеваниям, как синдром раздраженного кишечника, воспалительные заболевания кишечника, ожирение и диабет [18–20]. В свете ключевых ролей, которые отношения хозяин-микробиом могут играть в адаптации, было признано, что геномная адаптация сама по себе не может дать полного ответа на адаптацию стервятника для уборки мусора [8].Однако ни полное таксономическое разнообразие микробов (включая небактериальные микробы), ни каталог генов микробиомов лица и кишечника каких-либо видов стервятников не изучались на предмет их защитной роли против микробов, которые обычно представляют серьезный риск для здоровья других позвоночных, не питающихся падалью. разновидность.

Чтобы оценить защитную роль микробиома лица и кишечника стервятника, мы создали наборы метагеномных данных из мазков с лица и кишечника для двух видов стервятников Нового Света, черного стервятника ( Coragyps atratus ) и стервятника-индейки (). Cathartes aura ) и выполнили метагеномный таксономический и функциональный анализ.Мы определили широкий спектр таксонов и генов, которые могут вызывать серьезные заболевания, например сепсис, гангрена и пищевое отравление животным без защиты, обеспечиваемой специальным микробиомом. Такая защита может состоять из элементов защиты здоровья не только от бактериальных пробиотиков, но также от фагов и хищных эукариот. Наши результаты показывают, что микробиота стервятника играет важную роль в защите здоровья при его адаптации к питательной среде.

Методы

Метод отбора проб и секвенирование ДНК

Мы проанализировали подмножество набора образцов, использованного Roggenbuck et al. [21]. Вкратце, стервятников собирали в течение нескольких дней в Тенесси, США. Coragyps atratus были отловлены в живой ловушке на тушах оленей, а затем доставлены на центральный объект в течение нескольких часов после отлова. Затем они были умерщвлены CO 2 , вскрыты и взяты образцы в течение 30-45 минут после смерти. Cathartes aura грифов были отстреляны на насестах, упакованы в пакеты по отдельности и доставлены на перерабатывающий завод, где их охлаждали за 2-6 часов до вскрытия трупа и отбора проб.Образцы хранили в RNAlater, экстрагировали ДНК и готовили библиотеки для HiSeq PE 100 с использованием набора для сборки библиотек Nextera, следуя инструкциям производителя, как в Roggenbuck et al. [21]. Мы использовали в общей сложности 22 образца толстой кишки индюка ( Cathartes aura ) и 25 черных грифов ( Coragyps atratus ), а также 16 образцов лицевых органов индейки и 17 образцов лица черного стервятника.

Обработка данных

Для обработки необработанных чтений использовались два конвейера.В первом подходе мы удалили последовательности адаптеров и базы с качеством <15 с помощью Trimmomatic v0.32 [22]. Впоследствии, чтобы отфильтровать небактериальные считывания о птичьем, человеческом и фаговом происхождении Phi , наборы данных были сопоставлены с набором данных геномов птиц филогеномного проекта птиц [23] (который включает геном стервятника-индейки), человеческий (hg19) и фаговые геномы Phi , и были сохранены только считывания, не связанные с картированием. Второй подход был разработан для того, чтобы учесть возможное смещение k -mer в первых основаниях считываний, которое могло иметь последствия для последующей сборки de novo и предсказания гена.С этой целью мы урезали первые 16 баз чтения с помощью Trimmomatic v0.32, чтобы удалить смещение k -mer. Затем мы обработали эти считывания с помощью MOCAT [24], чтобы очистить их от низкокачественных оснований и адаптеров и сравнить их с геномами фага Phi , человека и грифов индейки.

Таксономическое профилирование

Мы использовали MGmapper [25] для сопоставления с bwa v0.7.10 [26] отфильтрованных очищенных чтений в следующих базах данных в полном режиме: MetaHitAssembly [27], HumanMicrobiome [28], ResFinder [29], Plasmid , Вирулентность, GreenGenes [30] и Сильва [31].Мы также сопоставили в цепном режиме следующие полные геномные базы данных, загруженные из GenBank в указанном порядке: человек, растения, позвоночные, беспозвоночные, простейшие, грибы и вирусы. Остальные считывания, не связанные с картированием, были сопоставлены в цепном режиме с базами данных полных геномов бактерий. Результаты MGmapper использовались для получения кривых разрежения из каждого набора данных с использованием собственного скрипта. Используя уникальные считывания карт, мы рассчитали охват (процент контрольной последовательности, охваченной считыванием) каждого идентифицированного вида и отфильтровали на его основе следующим образом:

  1. Мы использовали ослабленную фильтрацию, чтобы гарантировать идентификацию таксонов с низкой численностью , в котором мы удалили отождествления с 90% сигнала обилия, исходящего только от 3 образцов.

  2. Мы использовали более строгую фильтрацию, при которой, помимо удаления видов с низким сигналом численности, мы сохранили виды, идентифицированные с охватом более чем 1 -й квартиль (Qu) из распределения охвата соответствующей базы данных. . С помощью отфильтрованных таксонов мы идентифицировали те виды, которые присутствовали по крайней мере в 90% и 50% всех образцов, тем самым определяя более расслабленное и более строгое таксономическое общее ядро ​​микробиома лица и кишечника.

Для каждой базы данных мы сравнили таксоны, присутствующие только в наборах данных для лица и кишечника, таксоны, присутствующие в обоих, и таксоны, численность которых существенно различается ( P <0.05). Чтобы идентифицировать виды с различной численностью, мы выполнили t-тест на нормализованном распределении численности видов во всем наборе данных по лицу по сравнению со всем набором данных о кишечнике. Мы также оценили таксономические вариации внутри и между выборками между образцами лица и кишечника, вычислив евклидовы расстояния их нормализованной численности с использованием метода ward.D в R [32].

В качестве второго подхода мы использовали только считывание уникальных карт из MGmapper и сохранили таксономические идентификации до уровня вида, удалив малочисленные (90% сигнала, поступающего из менее чем 3 образцов) и нормализовав подсчеты.Мы использовали эти присвоения для проверки корреляции численности микробов путем вычисления корреляции Спирмена для каждого попарного сравнения микробов и рассчитали значения p ( P ) с поправкой Бонферрони для тех, у которых значение корреляции> 0,8 и <-0,7. Мы также исследовали обогащение и истощение таксонов в микробиоме лица и кишечника, получая их среднюю численность в образцах и сравнивая с общим распределением, чтобы вычислить скорректированный по Бонферрони P .Из этих заданий мы также получили конкретное лицо и ядро ​​кишечника. Мы определили два типа ядер: строгий, в котором мы сохраняем те, которые присутствуют как минимум в 80% образцов, и расслабленный, в котором мы сохраняем те, которые присутствуют как минимум в 50% образцов.

Мы также определили таксоны самых распространенных белков (те, которые имеют более 2000 считываний карт в наборе данных о лицах и 5000 в наборе данных о кишечнике) и проанализировали их основные компоненты (ПК) и их матрицу вращения, чтобы определить, какие таксоны управляют изменение микробиоты лица и кишечника внутри образцов.Мы определили как «драйверы вариаций» те, у которых значение матрицы абсолютного вращения больше, чем значение 3 rd Qu распределений из ПК1, ПК2 и ПК3, и как «драйверы без вариаций» те, у которых порог меньше этого порога.

Помимо идентификации MGmapper, мы использовали MOCAT в качестве третьего метода таксономической идентификации. Для этого подхода мы использовали строгую неизбыточную таксономическую аннотацию каталога генов MOCAT с минимальной длиной 80 аминокислот, без малочисленных, только бактерий, грибов и вирусов и с аннотацией Uniprot (см. Методы - Функциональное профилирование), которые мы проанализировали. с использованием MEGAN [33] в качестве входных данных поиск по Uniprot с использованием usearch [34].Мы использовали MEGAN для аннотирования микробных атрибутов и сравнения их нормализованного содержания в микробиомах кишечника и лица.

Патогенная характеристика

Мы искали потенциальные патогены в отфильтрованных бактериальных и плазмидных идентификациях. С этой целью мы загрузили список бактерий, отмеченных заболеванием, из базы данных Pathosystems Resource Integration Center (PATRIC) [35]. В PATRIC бактерии помечаются как патогенные, если они были зарегистрированы с экспериментальными данными как возбудители заболевания у вида.Мы дополнительно добавили уровень классификации патогенности бактериального штамма, используя список от van Belkum [36], который был разработан Commissie Genetische Modificatie (COGEM). Классы патогенности определены следующим образом. Класс 1 представляет виды, которые обычно не являются патогенными, хотя могут быть различия в вирулентности между штаммами видов, которые следует принимать во внимание. Класс 2 включает виды, которые могут вызывать болезни у людей или животных и которые маловероятны для распространения среди людей.А класс 3 включает виды, которые вызывают серьезные заболевания человека и могут распространяться среди людей. Используя метаданные патогенных штаммов, загруженные из PATRIC, мы также определили, способны ли бактерии к споруляции и устойчивости к противомикробным препаратам, вместе с заболеванием и указанным хозяином. Для идентификации патогенных плазмид мы использовали список, представленный Ho-Sui et al. [37], где они проанализировали ассоциацию факторов вирулентности с геномными островками патогенных бактерий.

Мы использовали R v3.1.1 [32] для изучения распределения общего числа идентифицированных патогенных бактерий. Мы сгруппировали образцы по и ) видам стервятников (индейка и черный стервятник) и ii ) по месту отбора проб тела (лицо и кишечник). Затем мы проверили с помощью двустороннего и одностороннего (альтернативно большего) t-теста, если средние значения распределений значительно различались. Затем мы исследовали количество образцов, в которых присутствовал каждый патогенный бактериальный штамм, плазмида, ген устойчивости и фактор вирулентности.Чтобы получить потенциально патогенное ядро, мы идентифицировали их в 50% и 90% образцов и сравнили те, которые уникальны для лица и кишечника.

Анализ численности патогенных бактерий

Чтобы проанализировать численность потенциально патогенных микробов в образцах, мы сначала изменили масштаб числа уникальных картографических считываний бактерий на их процентное содержание в образце. Впоследствии бактерии, присутствующие в небольшом количестве (те, у которых 90% сигнала поступало от 3 или менее образцов), были удалены.Чтобы увидеть, различаются ли образцы по выбранным частям тела (лицо или кишечник), мы использовали масштабированные значения для построения дендрограммы с использованием иерархической кластеризации на евклидовом расстоянии. Впоследствии мы исследовали, какие из сохраненных потенциально патогенных бактерий присутствовали только на лице или в кишечнике, а какие - в обоих. Затем мы использовали t-критерий, чтобы оценить, различалась ли численность присутствующих на лице и кишечнике статистически по месту отбора пробы и по видам стервятников.

Таксономическое сравнение бактерий 16S

Мы сравнили таксономические определения бактерий из наборов данных как по кишечнику, так и по лицу, полученные с помощью анализа 16S Roggenbuck et al. [21] против бактериальной идентификации из наших наборов данных метагеномики с использованием MGmapper и таксономической аннотации собранных генов de novo с помощью Uniprot. Впоследствии мы также использовали таксономические идентификаторы, полученные из некартированных считываний с помощью DIAMOND [38] для сравнения.

Функциональное профилирование

Используя сопоставление считываний с интересующими базами данных с помощью MGmapper и несопоставленных считываний, мы выполнили сборку de novo с помощью IDBA-UD [39] и предсказали гены с помощью Prodigal [40]. Впоследствии мы сгенерировали каталог неизбыточных (nr) генов с помощью usearch [34] путем кластеризации предсказанных генов с 90% идентичностью и сохранением центроидных последовательностей. Затем в каталоге генов nr был произведен поиск с помощью ublast [34] против Uniprot [41], и полученные в результате идентификации были функционально и таксономически аннотированы с использованием настроенного скрипта Python.Наконец, мы использовали DIAMOND v0.6.4 [38] blastx для поиска несопоставленных чтений в Uniprot, сохраняя только лучшее совпадение для последующей функциональной и таксономической аннотации. Мы сохранили как часть функционального ядра те гены, которые присутствуют в более чем заданном количестве образцов в соответствии с их распределением присутствия.

Для дальнейшей оценки на функциональном уровне мы преобразовали идентификаторы Uniprot id в KEGG [42] E.C id и соответствующий путь. Используя классифицированные белки, мы построили матрицу для выполнения анализа главных компонентов (PCA).Глядя на матрицу вращения из PCA, мы идентифицировали те пути с абсолютным значением вращения 1 , 2 и 3 ПК в пределах минимального и 1 -го значений Qu их распределений. Чтобы определить, какие пути вызывают большую часть различий между микробиомами лица и кишечника, мы определили те пути, для которых абсолютное значение вращения их 1 st , 2 и 3 rd ПК было больше или равно к значению 3 rd Qu их распределений.Чтобы проверить, схожи ли функциональные профили микробиомов лица и кишечника, несмотря на наличие больших вариаций типов внутри выборки, мы выполнили реплики понижающей выборки количества белков, соответствующих каждому пути класса, по минимальной численности распределения. Мы также получили евклидовы расстояния по измененным значениям матриц, используемых для PCA.

В качестве второго метода мы использовали MOCAT с SOAPdenovo v1.05 [43] для сборки de novo с очищенными чтениями при втором подходе.Впоследствии мы исправили сборку для инделей и химерных регионов с помощью SOAPdenovo. Затем с помощью prodigal мы предсказали гены из всех образцов, объединили их и построили каталог генов nr с uclust [34], используя 90% -ный порог идентичности. Это было сделано отдельно для наборов данных лица и кишечника. В подходе к определению ядра MGmapper каталог генов nr был получен для каждого образца, затем каталоги были объединены, и уникальные гены были сохранены для сравнения их наличия или отсутствия в образцах.Напротив, в этом подходе с использованием MOCAT мы построили ядра на основе количества считываний, отображаемых в каталоге генов nr. С этой целью мы сначала сопоставили чтения каждого образца с каталогом генов nr, затем изменили масштаб значений счетчиков, удалили гены с низким содержанием (гены с картированием менее 200 считываний), без аннотации Uniprot и те, которые не были получены из бактерии, археи, вирусы или грибы. Кроме того, для аннотации в белках должно быть не менее 80 аминокислот, выровненных по хиту Uniprot.Из этих белков мы также получили строгое (не менее 80% образцов) и более расслабленное (не менее 50% образцов) ядро. Мы также определили самые распространенные белки (те, у которых более 2000 считываний карт на лице и 5000 - в образцах кишечника). На расслабленном функциональном ядре мы выполнили функциональный анализ путей их E.C. id с помощью KEGG.

Устойчивость к антибиотикам

Для поиска генов устойчивости к антибиотикам, помимо поиска в базе данных ResFinder с помощью MGmapper, мы загрузили Resfams v1.2 [44], курируемая база данных по генам устойчивости к антибиотикам и связанный профиль скрытых марковских моделей. Мы провели поиск собранного набора гена nr de novo каждого образца по профилям Resfams, используя hmmscan из HMMER v3.0 [45].

Структура повреждений

Для проверки повреждений ДНК, вызванных кислотными условиями желудочно-кишечного тракта стервятника, мы использовали считывания, сопоставленные с наборами генов nr из наборов данных лица и кишечника, и использовали их в качестве входных данных для MapDamage [46], который рассчитывает неправильное включение нуклеотидов в 5 'и 3' крайних точках считывания ДНК.

Результаты

Набор метагеномных данных

Из общего числа 48 разных людей (25 Coragyps atratus и 23 Cathartes aura ) мы использовали 33 образца лица (17 Coragyps atratus ; 16 Cathartes aura ) и 47 образцов кишечника ( 25 C. atratus ; 22 C. aura ). Мы получили в общей сложности 342 279 763 пары сырых считываний из образцов лица и 512 803 778 из образцов кишечника. После очистки и удаления эндогенной ДНК путем картирования геномов птиц в рамках филогеномного проекта птиц [23] мы получили 79 938 910 пар считывания из лицевых образцов (со средним значением 1,378 000 пар считывания на образец) и 144 877 366 из образцов кишечника (с медиана 1,118,000 на образец) (дополнительный файл 1, таблица S1).

Чтобы доказать последовательность таксономического профилирования между двумя видами, мы сравнили количество идентифицированных таксонов у каждого вида. Мы отфильтровали идентификацию MGmapper [25] каждой полногеномной базы данных по глубине и широте (процент охваченной эталонной последовательности) охвата и определили таксоны, которые по-разному многочисленны в образцах лица и кишечника (таблицы S2, S3). Количество идентифицированных бактерий существенно не различается между видами стервятников ( P, = 0,52, C.atratus среднее значение = 366,97, C. aura среднее значение = 334,65). Ни для грибов ( P = 0,43, C. atratus среднее = 9, C. aura среднее = 7,5), вирусов ( P = 0,33, C. atratus среднее = 21, C. aura среднее значение = 28,2), плазмиды ( P = 0,68, C. atratus среднее = 186,85, C. aura среднее = 173,65) и простейшие ( P = 0,21, C. atratus среднее = 12. , C. aura среднее = 9,62). Кроме того, количество идентифицированных белков с устойчивостью к антибиотикам не различается между видами стервятников ( P = 0.64, C. atratus среднее = 107,5, C. aura среднее = 100,78). Мы сравнили нашу метагеномную идентификацию бактерий с идентификацией Roggenbuck et al. [21]. Всего с помощью 16S было идентифицировано 735 бактерий, из которых 93 не обнаружены среди наших метагеномных идентификаций со строгой фильтрацией. При использовании идентификаций с предварительной фильтрацией и идентификаций из Silva и GreenGenes только 14 родов не были идентифицированы (дополнительный файл 1).

Таксономическая характеристика

По сравнению с кишечником, микробиом лица имеет более высокое микробное разнообразие с точки зрения количества таксонов и различий между индивидуумами ( P простейших = 0.021, P грибов = 0,029, P бактерий = 0,000196) (Рисунки S1-S3), однако нет существенной разницы в численности (простейшие P = 0,514, P грибы = 0,47, P бактерии = 0,71). Хотя количество идентифицированных вирусов существенно не различается между лицом и кишечником ( P = 0,58), они статистически менее многочисленны и изменчивы на лице, чем в микробиоме кишечника ( P численность = 0,00017, евклидово расстояние лица = 9. .04, кишка Евклидово расстояние = 13,14). Большинство бактерий, присутствующих в более высоком количестве в микробиоме лица, относятся к Pseudomonas , Bacteroides и Prevotella , в то время как большинство бактерий, присутствующих в более высоком количестве в микробиоме кишечника, - это Escherichia , Campylobacter и . Clostridium (дополнительный файл 2, рисунок S4).

Мы идентифицировали в общей сложности 143 бактериальных штамма, значительно более распространенных в микробиоме лица, 46 после широкой фильтрации (в основном принадлежащие Pseudomonas ).В кишечнике мы идентифицировали 56 бактериальных штаммов, 33 после широкой фильтрации (в основном принадлежащие Escherichia и Campylobacter ). Те, которые более многочисленны в наборе данных, можно разделить на i ) потенциальных патогенов, ii ), связанных с биоремедиацией (устойчивые к ионизирующим воздействиям, восстановители тяжелых металлов или разлагающие масла), и iii ) потенциально полезные (производители антибиотиков. , инсектициды и противогрибковые средства), обычно кишечные бактерии и связанные с водой, растениями или почвой.И те, которых значительно больше в наборе данных о кишечнике, можно классифицировать как i ) потенциальные патогены, ii ) потенциально полезные, обычно кишечные или фекальные бактерии курицы, и iii ) ферментеры и продуценты кишечных метаболитов или промежуточных метаболических веществ. .

Из сопоставления считываний с каталогами наборов генов nr, полученными с помощью MOCAT, таксоны самых распространенных белков в микробиоме лица относятся к Sporidiobolales (грибы), Orthoretrovirinae (вирус), Pleosporaceae ( грибов), Bacillus cereus , Streptococcus и Clostridiales .В микробиоме кишечника они происходят из Bordetella , Mycobacterium , Chlamydia , Clostridium , Blautia (вид, идентифицированный в кишечнике млекопитающих [47,48]) и Carnobacterium (некоторые виды имеют консервативные свойства мясных продуктов за счет ингибирования роста Listeria monocytogenes [49,50]). Результаты поиска Uniprot, проанализированные с помощью MEGAN (рис. 1, 2), показывают, что в микробиоме лица доминирующей популяцией являются Proteobacteria , за которыми следуют Bacteriodetes , Firmicutes и Actinobacteria , с Fusobacteria . на 12 месте.Более глубокое изучение Proteobacteria из микробиома лица показывает, что наиболее распространенными таксонами являются Burkholderiales из Betaproteobacteria и Pseudomonadales из Gammaproteobacteria (рис. 1B). Внутри Pseudomonadales наиболее распространенным таксон является Psychrobacter (в основном P. cryohalolentis и C. articus ), за которым следует Pseudomonas (в основном P.stutzeri , P. aeruginosa и P. putida ) (рис. 1D-F). Из Bacteroidetes наиболее распространенными таксонами являются Prevotellaceae (в основном P. ruminicola ) и Flavobacteriaceae (в основном из неклассифицированных Flavobacteriaceae , за которыми следуют родов Flavobacterium ) (рис. 1C).

Рис. 1. Таксономический профиль микробиоты лица с каталогом генов nr, отфильтрованным MEGAN.

( A ) Уровень типа, ( B ) Proteobacteria, ( C ) Bacteroidetes, ( D ) Pseudomonadales, ( E ) Pseudomonas и ( F ) .

Рис. 2. Таксономический профиль кишечной микробиоты с каталогом генов nr, отфильтрованным MEGAN.

( A ) Уровень филума, ( B ) Firmicutes, ( C ) Proteobacteria, ( D ) Clostridiales, ( E ) Clostridium и ( F ) Fusobacterium

Микробиом кишечника состоит из Firmicutes как наиболее распространенных типов, за которыми следуют Proteobacteria , Fusobacteria на третьем месте и гораздо менее распространенные Bacteroidetes на четвертом месте.Более глубокое исследование микробиома кишечника Firmicutes показывает, что наиболее распространенными таксонами являются Clostridia (рис. 2B), среди Clostridiales наиболее распространенным таксон является Clostridiaceae , за которым следуют Peptostreptococcaceae iraceae Рис. 2D). Из Clostridium наиболее многочисленными таксонами являются потенциальные патогены C. perfringes и C. butilinium , за которыми следуют полезные C.carboxinovorans , C. sporogenes и C. butyricum (рис. 2E). Из Proteobacteria наиболее распространенными таксонами являются Burkholderiales из Betaproteobacteria , Epsilonproteobacteria из подразделения дельта / эпсилон и Enterobacteriales (в основном из Escherichia ) из 900obacroteobacteria из 900obacroteobacteria . ). Глядя на Fusobacteria , можно увидеть, что наиболее распространенными таксонами являются потенциальные патогены Fusobacterium mortiferum , F.varium и F. ulcerans , за которыми следует орально родственный Fusobacterium (рис. 2F).

Многие Clostridia , обычно являющиеся частью нормального кишечного микробиома человека, обнаруживаются в кишечнике стервятника, вероятно, выполняя соответствующие пищеварительные функции (дополнительный файл 3). Например, мы определили, что в кишечнике значительно более многочисленны C. saccharolyticum , выделенные из осадка сточных вод бактерии, которые ферментируют различные углеводы в уксусную кислоту, водород, углекислый газ и этанол [51], функции, для которых мы идентифицировали родственные гены.Кроме того, деструкторы целлюлозы C. cellulovorans и C. lentocellum [52] значительно более распространены в микробиоме кишечника, для которого мы идентифицировали гены, связанные с деградацией целлюлозы. Микробиом кишечника стервятника также содержит Bacteroides xylanisolvens , который расщепляет ксилан в кишечнике человека [53], и для которого мы идентифицировали ген, связанный с этой функцией. Кроме того, в микробиоме кишечника значительно больше, чем на лице, C. beijerinckii , который производит бутанол, ацетон и изопропанол с использованием различных субстратов, таких как пентозы, гексозы и крахмал [54], и C.saccharobutylicum , бактерии, продуцирующие бутанол и этанол [55].

Мы также идентифицировали гены, кодирующие белок, участвующие в биосинтезе витаминов в функциональном ядре строгого MOCAT nr кишечника. Например, мы идентифицировали D-трео-альдозо-1-дегидрогеназу, участвующую в метаболизме аскорбата и альдарата, биосинтезе кобаламина, биосинтезе рибофлавина, биосинтезе тиамина (витамин B 1 ), 2-кетопантоатредуктазу, участвующую в производстве витамина B 5 [56], от родов Hydrogenophaga , Herbaspirillum и Gordonia .Во втором типе ядра MGmapper, в ядре гена без учета таксонов, мы выявили большее количество генов, аннотированных как принадлежащих к метаболизму кофакторов и витаминов, чем на лицо, таких как биосинтез фолиевой кислоты, витамин B 6 метаболизм, метаболизм рибофлавина и метаболизм ретинола. Мы также идентифицировали гены биосинтеза различных незаменимых аминокислот.

Сравнение вариаций микробиома лица и кишечника

На основе PCA по численности идентифицированных видов в наборах данных лица и кишечника (рис.3AB), мы обнаружили, что 117 из 803 видов, идентифицированных как приводящие к изменению микробиома лица, являются патогенными бактериями для млекопитающего-хозяина (например, виды из родов Bordetella , Gordonia , Shigella , Yersinia , Brucella , Prevotella и Treponema ), связанные с почвой или растением, а некоторые - с поверхностями слизистых оболочек и нормальной микрофлорой полости рта ( Neisseria и Nocardia ). К 406 видам, не влияющим на большую часть изменчивости, относятся роды, связанные с биоремедиацией (например,грамм. Acinetobacter ), а также других патогенов ( Arcobacter и Brucella ). Фаги Clostridium , Pseudomonas , Shigella и Staphylococcus относятся к числу невариантных, а фаги Samonella , Aeromonas и Erwinia относятся к числу вариантов.

Рис. 3. PC1 vs PC2 обилия на уровне таксономических видов.

( A ) микробиом лица, ( B ) микробиом кишечника и виды ( C ) присутствуют как на лице (красный), так и на кишечнике (зеленый).

В образцах кишечника мы идентифицировали 604 вида, которые значительно отличались между образцами, и 348 видов, не являющихся драйверами вариаций. Драйверы изменчивости включают 112 потенциально патогенных бактерий, таких как виды из родов Listeria , Shigella , Yersinia , Bordetella , Shewanella , Erwinia и Vibrio . А не-драйверы включают виды из родов Escherichia , Bacillus , Brucella и Clostridium , среди других.Невариантные драйверные фаги включают фаги для Escherichia , Enterobacteria и Shigella . В то время как эти управляющие вариации включают фаги для Clostridium , Yersinia и Pseudomonas .

Изучая 879 видов микробов, общих для образцов лица и кишечника (рис. 3C), мы определили 553 вида как движущие факторы (62,9%) и 326 видов как движущие факторы без вариаций (37,1%). Среди драйверов вариаций - Yersinia , Ralstonia , Rhizobium , Bifidobacterium , Bordetella , Listeria и Burkholderia .Эти неизменяемые драйверы включают Brucella , Treponema , Clostridium и Campylobacter . Если посмотреть на фаги, то только фаги Pseudomonas являются драйверами вариаций, в то время как невариантные драйверы включают фаги для Clostridium , Enterobacteria , Erwinia и Shigella .

Характеристика функционального потенциала

PCA каталога набора генов MGmapper nr объединенного микробиома лица и кишечника, аннотированного KEGG, демонстрирует меньшие вариации, чем таксономический профиль.PC1 анализа каждого класса путей объясняет 78% -99% дисперсии. Из графиков PC1vsPC2 ясно, что PC1 разделяет образцы по их функциональному составу, который аналогичен, в то время как PC2 разделяет их по их происхождению выборки (лицо или кишечник) (рис. 4, рис. S5). Чтобы проверить, очень ли похож профиль функционального потенциала микробиомов лица и кишечника, несмотря на большую вариацию типов внутри выборки, мы уменьшили количество белков, соответствующих пути данного класса, по минимуму распределения.Полученные в результате PCA с пониженной выборкой показывают уменьшенный масштаб в PC1, в то время как масштаб PC2 не меняется, и образцы в значительной степени перекрываются (рис. 5), подтверждая наше наблюдение функционального сходства, несмотря на различия.

Рис. 4. ПК1 и ПК2 каждого класса путей.

Красные точки - это образцы из набора данных лица, зеленые точки - из набора данных кишечника. Рассматриваются следующие классы путей (слева направо, сверху вниз): метаболизм аминокислот, метаболизм других вторичных метаболитов, метаболизм углеводов, энергетический обмен, биосинтез и метаболизм гликанов, метаболизм липидов, метаболизм кофакторов и витаминов, метаболизм других аминокислот. кислоты, метаболизм терпеноидов и поликетидов, а также биодеградация и метаболизм ксенобиотиков.

Рис. 5. PC1 по сравнению с PC2 для каждого класса путей с пониженным количеством взятых белков.

Красные точки взяты из образцов лиц, зеленые точки из наборов данных кишечника. Рассматриваются следующие классы путей (слева направо, сверху вниз): метаболизм аминокислот, метаболизм других вторичных метаболитов, метаболизм углеводов, энергетический обмен, биосинтез и метаболизм гликанов, метаболизм липидов, метаболизм кофакторов и витаминов, метаболизм других аминокислот. кислоты, метаболизм терпеноидов и поликетидов, а также биодеградация и метаболизм ксенобиотиков.

Если посмотреть на матрицу вращения из PCA, 60,4% (87) субпутей вызывают вариации между микробиомами лица и кишечника. Анализируя внутренние вариации типа образца, 57% подпутей на лице (81) и 55,94% (80) в наборах данных кишечника управляют сравнением типов внутри образца. Мы определили 59 генов в верхних 5% генах-драйверах вариаций с наибольшей средней разницей в изобилии между лицом и кишечником. Из этих генов 18 соответствуют метаболизму аминокислот (17 присутствуют только в образцах кишечника и 1 только в образцах одного лица), 15 генов связаны с метаболизмом углеводов (все они только в образцах кишечника) и 7 генов соответствуют метаболизму кофакторов и витамины (все только в образцах кишечника).Мы обнаружили, что 44% генов (921 из аннотированных KEGG 2093 объединенных ядра генов с расслабленным лицом и кишечником) не управляют изменчивостью. 46 генов верхних 5% с наименьшей средней разницей в количестве между лицом и кишечником соответствуют метаболизму аминокислот, углеводов, кофакторов и витаминов, биосинтезу и метаболизму гликанов, метаболизму липидов, энергетическому метаболизму, разложению хлорциклогексана и хлорбензола, метаболизму. терпеноидов и поликетидов, а также метаболизм других аминокислот.

На основании измерений евклидова расстояния кишечник имеет меньшую вариацию внутри образца, чем лицо (таблица 1, P = 0,002). Расстояние между микробиомом лица составляет от 3,2 до 6,21, а в микробиоме кишечника - от 2,175 до 3,676. Анализ всех функций вместе (рис. S6), а не по классам путей (рис. 5, рис. S7), показывает, что микробиомы лица и кишечника четко разделяются на 2 разных кластера (PC1 = 0,847, PC2 = 0,075). Функциональная характеристика MOCAT дала в общей сложности 38 403 гена nr из набора данных лица и 50 106 генов nr из набора данных кишечника.Основываясь на нормализованном количестве считываний карт, мы идентифицировали 1507 генов в строгом ядре лица, 7215 в расслабленном и 157 очень распространенных генов (всего более 2000 считываний карт). Мы обнаружили 2512 генов в строгом ядре кишечника, 14 028 в расслабленном и 151 наиболее распространенных (с более чем 5000 считываний карт).

Таблица 1. Таблица 1. Расстояния между образцами лица и кишечника и внутри них.

Идентификация основного микробиома и сравнение атрибутов

В отфильтрованном таксономическом профиле MGmapper мы идентифицировали 1483 вида в образцах лица, 638 из которых присутствуют как минимум в 50% образцов (расслабленное ядро) и только 184 вида - как минимум в 80%. образцов (строгое ядро).В микробиоме кишечника мы обнаружили 1419 видов микробов, из которых только 322 присутствуют как минимум в 50% образцов, а 129 - как минимум в 80%. При функциональной характеристике мы идентифицировали в общей сложности 238 065 уникальных бактериальных генов nr в микробиоме лица и 387 951 уникальных бактериальных генов nr в микробиоме кишечника (дополнительный файл 4, таблицы S4, S5).

Мы сравнили таксономический и функциональный состав лица и кишечника, а также специфические микробные атрибуты таксонов, идентифицированных из аннотаций собранных генов (дополнительный файл 2).Мы обнаружили на лице в ~ 26 раз больше микробов, специфичных для среды обитания, чем в микробиоме кишечника (лицо = 8,373, кишечник = 320), и, согласно анаэробной среде кишечника, в микробиоме кишечника примерно в 5 раз больше анаэробных или микроаэрофильных бактерий, чем в микробиоме лица. (кишечник = 34 749, лицо = 6 699). Единственными двумя функциональными путями, четко разделенными по типу образца, являются метаболизм липидов и углеводов, за которым в меньшей степени следует биосинтез других вторичных метаболитов, а также биосинтез и метаболизм гликанов (рис.4). Из класса энергетического метаболизма метаболизм метана является одной из самых распространенных функций микробиомов лица и кишечника (рис. S7).

Патогенная характеристика

Нет существенной разницы в количестве идентифицированных потенциально патогенных плазмид между микробиомами лица и кишечника ( P = 0,44, среднее значение лица = 11,3, среднее значение кишечника = 9,82) (Рисунок S8A), и есть статистической разницы в их численности нет ( P = 0,775). Кроме того, в 90% образцов нет потенциально патогенной плазмиды.Среди тех, что присутствуют по крайней мере в 50% образцов, присутствуют плазмиды из Burkholderia vietnamiensis , Escherichia coli и Ochrobactrum anthropic . Фаг, превращающий токсин 1 шига ВР-4795, который передает гены вирулентности инфицированным бактериям [57], был обнаружен только в 5 образцах лиц и в 23 образцах кишечника с разной численностью (макс. Охват = 17,9%). , макс. чтение отображения = 372). Мы также обнаружили фаг SfIV Shigella , который способствует вирулентности Shigella flexneri [58], в 25 образцах кишечника и 8 образцах лица.Потенциально патогенные плазмиды, присутствующие только в микробиоме лица, происходят от условно-патогенных микроорганизмов, таких как Acinetobacter baumannii , Staphylococcus epidermidis , которые обычно являются частью нормальной кожной флоры [59]. Например, плазмида pOANT04 Ochrobactrum anthropi ATCC 49188 присутствует в 63 образцах. O. anthropi все чаще признается потенциально проблемным условно-патогенным и нозокомиальным патогеном человека [60]. Изучая уровень патогенности различных бактериальных патогенов, мы обнаружили, что 75.2% отнесенных патогенов относятся к уровню 2 в образцах лица (79 - к уровню 2 и 26 - к уровню 1), а 95,8% наиболее распространенных в кишечнике патогенов относятся к уровню 2 (46 уровень 2 и 2 уровень 1).

Используя таксономические аннотации собранных генов, мы обнаружили, что единственным белком из строгого ядра MGmapper, идентифицированным в наибольшем количестве образцов лица (20) и образцов кишечника (36), был неохарактеризованный белок из Chlamydophila psittaci , an птичий патоген, вызывающий птичий хламидиоз, и эпизоотические вспышки у млекопитающих [61].Среди вирусов этого функционального строгого ядра мы обнаружили птичий эндогенный ретровирус EAV-HP и вирус птичьего лейкоза. Мы также определили более высокую численность в наборе данных о кишечнике Trichuris trichiura , вызывающем трихоцефалез у людей [62,63] (максимальное количество считываний карт в образцах лиц = 942, максимальное количество считываний карт в образцах кишечника = 565 870) и Eimeria brunetti , возбудитель геморрагического кишечного кокцидиоза у домашней птицы [64] (макс. Отображение на образцах лиц = 30, макс.отображение показывает в образцах кишечника = 1706). Более многочисленная в наборе данных по забоям мы идентифицировали муху Lucila cuprina (средняя численность в пробах кишечника = 11 910, средняя численность в пробах забоя = 49 210), которая вызывает забастовку овец [65].

Чтобы подчеркнуть важность уборки, которую стервятники оказывают окружающей среде, мы искали бактерии, способные к зоонозу и споруляции [3], значительно более распространенные в микробиоме кишечника, чем на лице, поскольку это те которые потенциально могут вернуться в окружающую среду через фекалии стервятника.Мы идентифицировали только 49 бактерий в наборе данных кишечника с потенциалом споруляции, включая Fusobacterium necrophorum , Campylobacter jejuni и Listeria monocytogenes (Рисунок S9). Что касается бактерий, считающихся зоонозными патогенами, мы смогли идентифицировать только Streptococcus suis , патоген для свиней, способный передаваться человеку от свиней [66]. Другие идентифицированные бактерии с заявленной зоонозной способностью имели очень низкую численность и присутствовали только в одном или двух образцах, так что они, вероятно, представляют собой нежизнеспособные бактерии, с которыми уже имел дело гриф. Оценка защиты от кислотности желудка

Чтобы исследовать влияние кислотности желудка на микробиоту кишечника и оценить ее кислотность как защитный механизм со стороны физиологии стервятника, мы рассмотрели ранее опубликованные измерения pH в желудках с содержанием пищи из 13 диких животных. черные грифы [67]. Чистая кислотность желудка составляла 1,5-2,0 pH. Большое стандартное отклонение наблюдалось в показаниях pH желудка испытанных черных грифов (2,0-5,6, x = 3,8 + 1,25). Напротив, показания pH сверху (5.6-7,3, x = 6,1 + 0,48) и нижняя часть кишечника (5,9-7,0, x = 6,0 + 0,3) были более однородными, поскольку сама среда гомогенизирована и имеет высокое содержание жидкости. Чтобы дополнительно проверить гипотезу о защите от кислотности желудка, мы проанализировали паттерны повреждений и распределение длин считываний ДНК, сопоставленных с каталогом набора генов nr кишечника. Мы не идентифицировали какой-либо паттерн повреждений в ДНК на лице или в наборах данных кишечника, а также не идентифицировали бимодальное распределение длины считывания в наборе данных кишечника. Распределение длин считывания ДНК лица и кишечника было унимодальным и сходным (рис. S10).Интересно, что мы идентифицировали беспозвоночного Clonorchis sinensis в 22 образцах лица и 39 образцах кишечника (66,6% образцов лица и 83% образцов кишечника). Эта печеночная двуустка питается желчью и вызывает проблемы с перевариванием жиров, а также способна достигать кишечника хозяев, учитывая ее устойчивость к кислотности [68].

Обсуждение

Состав и изменчивость микробиома

Сравнение нашей метагеномной идентификации бактерий с идентификацией Roggenbuck et al. [21] подтверждают согласованность таксономических определений. Учитывая, что мы стремимся охарактеризовать микробиом стервятника, связанный с уборкой мусора, в свете предыдущих наблюдений, что микробиота кожи и кишечника индейки и черного стервятника в значительной степени перекрывается [21], мы объединили наборы данных по обоим видам стервятников в один. Результаты сравнения количества идентифицированных таксонов у каждого вида доказывают, что микробиомы этих двух видов стервятников статистически не различаются (Рисунок S11), и подтверждают их совместное использование.Мы выявили поразительно большие таксономические и функциональные вариации как в наборах данных по кишечнику, так и по лицу (рис. 3, 4, 6A). Изучение PCA на основе характеристики функционального потенциала предполагает, что функциональный профиль микробиомов лица и кишечника очень похож, несмотря на большие вариации типов внутри образца. Это предположение подтверждается PCA набора данных с пониженной выборкой до минимума распределения каждого класса путей (рис. 5), что дополнительно предполагает, что относительное содержание белков, а не их наличие / отсутствие является одним из основных факторов. основные факторы, отличающие лицо от функционального профиля микробиома кишечника.По сравнению с микробиомом лица кишечник имеет меньше функциональных вариаций внутри образца (таблица 1, P = 0,002). Это согласуется с тем фактом, что морда - это первая часть тела стервятника, которая соприкасается с тушей. В целом, идентифицированные таксоны из микробиомов кишечника и лица могут быть классифицированы как производные от хозяина i ), такого как Methanobrevibacter smithii в кишечнике и ii ) окружающей среды и туши, например Xanthomonas и Actinobacillus pleuropneumoniae .Учитывая, что наиболее распространенные микробы лица могут быть связаны с множеством микробных признаков, начиная от продуцентов противогрибковых и заканчивая обычными кишечными бактериями и бактериями, связанными с растениями и почвой, очевидно, что существует значительный вклад окружающей среды и флоры туши в весьма изменчивую структуру стервятника. микробиом лица. С другой стороны, наиболее распространенные в кишечнике бактерии связаны в основном с кишечными или фекальными бактериями, что отражает пищеварительные и более специализированные функции, которые, как ожидается, будут выполняться в кишечнике.Наши данные подтверждают предыдущие результаты, основанные на ПЦР [21], которые идентифицируют Clostridia и Fusobacteria как доминирующие таксоны в микробиоме кишечника (рис. 2, 6C). Как и ожидалось, в микробиоме кишечника есть четкие черты, необходимые для осуществления пищеварительной и пищевой деятельности, которые мы определили в наших наборах данных.

Рис. 6. Состав микробиома лица и кишечника стервятника.

( A ) Основные компоненты (ПК) 1 (28% вариации) и 2 (12,36%) изобилия всех генов из всех метаболических классов KEGG вместе образцов лица (красный) и кишечника (зеленый) .( B ) Таксономический профиль микробиоты лица и ( C ) кишечника. ( D ) Распределение количества идентифицированных потенциально патогенных бактерий в наборах данных кишечника и лица.

Уменьшенный основной микробиом хозяина

Чтобы отличить постоянный микробиом хозяина от микробиома, происходящего от переменных и внешних воздействий (т. Е. Микробов, происходящих из туши и окружающей среды), мы определили два типа ядер микробиома. Расслабленная сердцевина, содержащая элементы, присутствующие по крайней мере в 50% образцов, и строгая сердцевина, содержащая элементы, присутствующие не менее чем в 80% проб.Мы обнаружили, что расслабленное ядро ​​содержит ~ 43% и ~ 22,7% таксонов лица и кишечника, соответственно, а строгое ядро ​​содержит только ~ 1% таксонов в наборах данных как по кишечнику, так и по лицу (дополнительные примечания 1, 2). Примечательно, что различие между тушей и устоявшимся постоянным микробиомом, происходящим от хозяина, сложно даже после того, как были определены ядра. Например, пищевой патоген Salmonella enterica присутствует в ядре кишечника (рис. 6B). Мы дополнительно идентифицировали гены в строгих функциональных ядрах микробиома лица и кишечника, которые связаны с путресцином, одной из основных молекул, продуцируемых в туше (дополнительные примечания 1, 3, дополнительный файл 5).Мы обнаружили примерно в 26 раз больше микробов, специфичных для среды обитания, на лице, чем в микробиоме кишечника (лицо = 8,373, кишечник = 320), скорее всего, из-за того, что труп млекопитающего представляет собой среду обитания, вызывающую нарушение, которая выбирает специализированное микробное сообщество [7 ]. Некоторые из этих видов сообщества, вероятно, происходят от микрофлоры падальщика, например, мы идентифицировали бактерии, разлагающие фенол, в коже лица стервятника, такие как Acinetobacter calcoaceticus [69] (макс. Показания карт в образцах лиц = 478, макс.картирование считывает в образцах кишечника = 6), для которых мы идентифицировали его ген, кодирующий фенол-2-монооксигеназу, в каталоге генов nr. Фенольные соединения могут действовать против патогенов пищевого происхождения и бактерий порчи [70], предполагая, что они происходят от обитателей падали, адаптированных к их конкурентной среде, а не являются частью микробиома кожи лица стервятника. Таким образом, мы предполагаем, что микробиом стервятника является результатом его питательной диеты, при этом часть флоры туши оставляет глубокий след в микробиоме стервятника.

Проблемы патогенности

Учитывая идентификацию сильной сигнатуры микробиоты туши в микробиоме стервятника, мы затем охарактеризовали все потенциальные патогены, с которыми борются стервятники. Мы определяем потенциальные патогены как таксоны и функции, которые, хотя и присутствуют в микробиоме стервятников, не оказывая явно негативного воздействия на здоровье, могут быть смертельными для не-падальщиков. Большинство потенциально более многочисленных потенциальных патогенов, обнаруженных в микробиоме лица ( P <0.05), как известно, вызывают у млекопитающих заболевания, подобные сибирской язве, пародонтит, пневмонию и туберкулез, в то время как те, которые обнаруживаются в большей степени в кишечнике, вызывают гастроэнтерит, газовую гангрену, пищевое отравление и дизентерию у людей (рис. 6D, 7AB). ). Мы идентифицировали несколько патогенных плазмид в микробиоме кишечника, такие как фаг, конвертирующий токсин 1 шига ВР-4795, который передает гены вирулентности инфицированному Escherichia coli [57], а также гены микробиома лица, связанные с патогенностью, такие как гемолизины (дополнительный файл 6).Наш нецелевой метагеномический подход также позволил идентифицировать небактериальные потенциальные патогены в кишечнике, такие как круглый червь Trichuris trichiura , вызывающий трихоцефалез у людей [63], и апикомплексный паразит Eimeria brunetti , ответственный за геморрагический кокцидиоз кишечника у домашней птицы [63]. 64]. Эти результаты подчеркивают неблагоприятную для здоровья окружающую среду, с которой сталкивается стервятник из-за его скудной диеты.

Защита желудка от кислотности

Большинство идентифицированных потенциальных патогенов ограничено несколькими образцами, а численность патогенов не согласуется в образцах после нормализации подсчетов (Рисунок S12).Эти наблюдения могут быть связаны с изменением флоры туши или эффективным устранением потенциальных патогенов стервятником. Из-за ранее сообщенного очень кислого pH в желудках некоторых видов стервятников [3] было высказано предположение, что кислотность желудка стервятников служит фильтром для потенциальных патогенов [8,21]. Желудок с пищевым содержимым черного стервятника имеет pH 1,5–2,0 [67], что является обычным для млекопитающих уровнем. Приборные показания pH обычно выше в желудке с содержимым пищи, так как желудочная кислота разрежена и разбавлена ​​водой, содержащейся в кусках пищи.Последовательные и независимые значения датчиков в желудке часто могут давать разные показания, даже если датчик используется в одном и том же месте. Это отражается в больших стандартных отклонениях, наблюдаемых в ранее опубликованных показаниях pH протестированных черных грифов [67]. Кишечные измерения были менее кислыми и в некоторых случаях нейтральными. Учитывая, что флора туши попадает в тело стервятника в основном вместе с проглоченными пищевыми продуктами, измерения pH показывают, что кислотность желудочно-кишечного тракта не является эффективным фильтром против всех потенциальных патогенов, присутствующих в питательной диете, скорее она играет общую роль первичного отбора , чего недостаточно для всех потенциальных болезнетворных микроорганизмов в туше.При сравнении микробиомов лица и кишечника мы обнаружили, что на лице больше различных видов потенциальных патогенов, чем на кишечнике ( P = 0,036) (рис. 6D, таблица 2), однако статистической разницы в их составе нет. численность ( P = 0,82), а в кишечнике все еще находятся различные потенциальные патогены. Кроме того, отсутствие четкой картины повреждения в считывании может предполагать, что фильтрация микробов происходит в желудочной камере, таким образом, метагеном кишечника не состоит из мертвых и живых бактерий, если микробная фильтрация должна происходить в первую очередь там.Это также может указывать на то, что кишечные таксоны способны противостоять физиологическим желудочно-кишечным условиям стервятника, что подтверждается идентификацией Clonorchis sinensis. С другой стороны, отсутствие паттерна повреждений ДНК и отсутствие бимодальности распределения длин может указывать на то, что идентифицированный хищный эукариот Adineta vaga очищает микробиом кишечника от мертвых бактерий и простейших.

Таблица 2. 10 основных потенциальных заболеваний, вызывающих бактерии, выявленные на лице и кишечнике.

Защита, опосредованная микробиомом

Было показано, что микробы обеспечивают защиту хозяина от патогенных бактерий, таким образом, мы предположили, что микробиом стервятника играет защитную роль с точки зрения борьбы, предотвращения или поддержания баланса потенциальных патогенов. Соответственно, мы идентифицировали функциональные и таксономические защитные элементы, которые можно отнести к i ) таксонам и функциям полезных бактерий, ii ) фагам, iii ) хищным эукариотам и iv ) устойчивости к колонизации (рис.7C, дополнительное примечание 4).

Рис. 7. Проблемы со здоровьем, с которыми сталкивается стервятник.

(A) Стервятники сталкиваются с широким спектром микробов, происходящих из туш. ( B ), которые представляют серьезную патогенную опасность для видов, не питающихся падалью. ( C ) Различные потенциальные опосредованные микробиомом защитные механизмы определяют способность стервятника переносить и снижать потенциальный риск для здоровья, который представляет тушка при прохождении через пищеварительную систему.

Таксоны полезных бактерий

В соответствии с нашей гипотезой о защите, опосредованной микробиомом, мы идентифицировали Hylemonella gracilis как часть лицевого ядра, которое, как было показано, предотвращает долгосрочную колонизацию Yersinia pestis [71].Другие полезные бактерии, присутствующие как в кишечнике, так и в микробиомах лица, включают Lactobacillus sakei , антистериальные бактерии [72]. Мы также идентифицировали несколько генов биосинтеза антибиотиков, таких как карбапенем, тетрациклин, макролиды и ансамицины, а также гены устойчивости к ним (дополнительный файл 6). Идентификация таксонов и генов, связанных с инсектицидами, фунгицидами и противопаразитарными средствами, в микробиоме лица предполагает защитные механизмы против возможных эукариотических патогенов, присутствующих в туше (дополнительный файл 6), таких как Pseudomonas entomophila , вызывающие летальность у мух [73], для которых мы наблюдали ген, кодирующий инсектицидный токсин класса SepC / Tcc в каталоге неизбыточных генов лица (дополнительное примечание 5).В почвенных микробиомах известно производство антибиотиков для того, чтобы побеждать за ресурсы, и недавно сообщалось о подобных стратегиях в носовом микробиоме человека с использованием комменсальных бактерий против патогенов [74]. Наши результаты показывают, что микробиом лица стервятника играет аналогичную защитную роль. Что касается кишечного микробиома, известно, что комменсальные Clostridia играют важную роль в производстве бутирата, который используют колоноциты [75]. Примечательно, что C. butyricum является одной из самых распространенных Clostridia в микробиоме кишечника.

Полезные бактериальные функции

Помимо содержания потенциальных патогенных микробов, туши также содержат токсичные и канцерогенные соединения [76], которые представляют опасность для здоровья стервятника, особенно для его голой кожи лица, которое находится в прямом контакте с такими соединениями. Среди бактерий, обнаруженных в более высоком количестве в микробиоме лица, находится Arthrobacter phenanthrenivorans , который способен разлагать фенантрен, вызывающий раздражение кожи полициклический ароматический углеводород (ПАУ).ПАУ - это ксенобиотические загрязнители с негативным воздействием на здоровье, которые выделяются из туш животных [77], и ранее сообщалось о высоких концентрациях у других видов стервятников [78]. Интересно, что наибольшая вариация метаболизма биодеградации ксенобиотиков внутри образцов была в наборе данных по лицу (дополнительный файл 5), причем метаболизм деградации ПАУ является наиболее распространенным подклассом пути разложения ксенобиотиков как на лице, так и в кишечнике. Эти данные свидетельствуют о защитной роли стервятника в микробиоме против таких соединений.Что касается микробиома кишечника, второй по численности Fusobacteria в кишечнике из неизбыточного набора генов является продуцирующий кишечный бутират F. varium [79], для которого мы также идентифицировали его ген формиат C-ацетилтрансферазу. , который участвует в метаболизме бутаноата, как самый распространенный ген в наборе данных о кишечнике. Интересно, что помимо использования бутирата для колоноцитов было показано, что глицериды бутирата обладают антимикробной активностью против C. perfringens и Salmonella typhimurium [80].

Количество патогенов, контролируемое фагами

Было показано, что фаги в микробиоме кишечника человека играют защитную роль, а возрастающая идентификация генов устойчивости к антибиотикам у патогенных бактерий привела к предложению использовать фаги в качестве альтернативных методов лечения [81]. Учитывая идентификацию потенциальных генов устойчивости к антибиотикам в микробиомах лица и кишечника стервятников (дополнительное примечание 6, рисунки S13, S14), мы исследовали возможную роль фагов в устранении или балансировании численности потенциальных патогенов.В микробиоме лица фагов Clostridium положительно коррелируют с Clostridium perfringes и Clostridium botulinum , тогда как в кишечнике мы вместо этого наблюдали фаги энтеробактерий, коррелирующие с Escherichia fergusonii (дополнительный файл 7). Кроме того, в таксономических аннотациях функционального ядра кишечника мы идентифицировали фаг Salmonella SPN3US (дополнительный файл 8), который продемонстрировал эффективное ингибирование Salmonella enterica [82].Из лицевого функционального строгого ядра наиболее распространенным вирусом является фаг BPP-1 (дополнительный файл 8), который инфицирует патогенные бактерии Bordetella [83]. Эти результаты показывают, что наборы фагов как в микробиомах лица, так и в кишечнике связаны с присутствием потенциальных патогенов, наиболее распространенных в соответствующем типе образца, и предполагают, что фаги могут представлять, как и фаговая терапия, альтернативный защитный механизм для контроля и, возможно, устранение потенциальных патогенов [84] (дополнительное примечание 5, рисунок S15).

Хищный защитный механизм

Несмотря на то, что они являются важными элементами микробиома кишечника, кишечные микробные эукариоты остаются в значительной степени неизученными. Таким образом, мы исследовали, играют ли микробные эукариоты кишечника стервятника какую-либо защитную роль. Мы определили, что беспозвоночное Adineta vaga , которое питается мертвыми бактериями и простейшими, в ядре кишечника примерно в 6,8 раз больше, чем в лицевом ядре. Эта идентификация предполагает, что хищный механизм может быть использован для защиты в кишечнике стервятника.

Устойчивость к образованию биопленок и колонизации

Биопленки представляют собой совокупность микробов, связанных внутри матрикса, состоящего из внеклеточных полимерных веществ, который способствует их адгезии к поверхности, защите от антимикробных препаратов и лучшему усвоению питательных веществ. Было высказано предположение, что изобилие Fusobacteria в кишечнике играет особенно важную роль в образовании биопленки просвета желудочно-кишечного тракта [85]. Чтобы исследовать эту гипотезу, мы провели поиск белков, связанных с образованием биопленок (дополнительный файл 8).В основе функционального потенциала кишечника мы идентифицировали связанные с биопленкой белки из Fusobacterium mortiferum , такие как рубреритрин, а также из Clostridium perfringens , такие как UDP-глюкуроновая ацидепимераза. Учитывая, что бактерии образуют биопленки, в которых они могут процветать при различных моделях экспрессии генов [86], это предполагает, что идентифицированные потенциальные патогенные Clostridia и Fusobacteria из микробиома кишечника могут не представлять патогенных рисков и вместо этого обеспечивать устойчивость к колонизации по сравнению с другими бактериями. внешние патогены (дополнительное примечание 5).Для дальнейшего изучения роли устойчивости к колонизации Clostridia и Fusobacteria мы исследовали функциональное ядро ​​кишечника на предмет токсинов, потенциально влияющих на стервятника. Мы идентифицировали только несколько потенциально патогенных кодирующих токсин генов из Fusobacterium (дополнительный файл 9), и было показано, что F. varium оказывает положительное влияние на своего хозяина-человека, противодействуя колонизации патогенными агентами [87]. Это предполагает, что важной ролью кишечника Fusobacteria может быть образование биопленок и устойчивость к колонизации, не представляя серьезной патогенной угрозы.Мы идентифицировали гены патогенности перфринголизина О и фосфолипазы С в микробиоме кишечника из C. perfringens . Однако мы также идентифицировали гены биосинтеза короткоцепочечных жирных кислот из Clostridia , которые могут обеспечивать защиту от воспалительных реакций [88]. Таким образом, мы можем разделить наблюдаемые Clostridia на два типа: i ) потенциально патогенные, в основном представленные C. perfringens и ii ) непатогенные, которые могут способствовать образованию биопленок и защите здоровья ( Дополнительный файл 10).

Защитная роль микробиомов лица и кишечника стервятника способствует адаптации к мусору

% PDF-1.7 % 1 0 obj > / Metadata 5 0 R / Outlines 2 0 R / Pages 3 0 R / StructTreeRoot 4 0 R / Type / Catalog / Viewer Preferences 6 0 R >> эндобдж 5 0 obj > поток application / pdf

  • лисандра
  • Защитная роль микробиомов лица и кишечника стервятника в адаптации к уборке мусора
  • Microsoft Word2017-10-30T17: 21: 54Z2021-04-21T01: 50: 48-07: 002021-04-21T01: 50: 48-07: 00uuid: BF319549-4904-48D1-A6BF-7B2173240584uuid: 3dfbced6-1dd2-11b2 -0a00-810000000000 конечный поток эндобдж 2 0 obj > эндобдж 3 0 obj > эндобдж 4 0 obj > эндобдж 6 0 obj > эндобдж 55 0 объект > эндобдж 56 0 объект > эндобдж 162 0 объект [208 0 R 208 0 R 208 0 R 208 0 R 209 0 R 209 0 R 209 0 R 209 0 R 210 0 R 210 0 R 211 0 R 211 0 R 211 0 R 211 0 R 211 0 R 212 0 R 212 0 R 212 0 R 212 0 R 213 0 R 213 0 R 213 0 R 213 0 R 214 0 R 214 0 R 214 0 R 214 0 R 214 0 R 214 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 215 0 R 216 0 R 216 0 R 216 0 R 216 0 R 217 0 R 217 0 R 218 0 R 218 0 R 218 0 R 218 0 R 219 0 R 219 0 R 220 0 R 220 0 R 221 0 R 221 0 R] эндобдж 163 0 объект [222 0 R 222 0 R 223 0 R 223 0 R 223 0 R 223 0 R 223 0 R 223 0 R 223 0 R 223 0 R 223 0 R 223 0 R 223 0 R 223 0 R 223 0 R 223 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 224 0 R 225 0 R 225 0 R 225 0 R 225 0 R 225 0 R 225 0 R 225 0 R 225 0 R 225 0 R 225 0 R 226 0 R 226 0 227 рандов 0 227 рандов 0 227 рандов 0 227 рандов 0 рандов] эндобдж 164 0 объект [228 0 R 228 0 R 229 0 R 229 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 230 0 R 231 0 R 231 0 R 231 0 R 231 0 R 231 0 R 231 0 R 231 0 R 231 0 R 231 0 231 0 R 231 0 R 231 0 R 231 0 R 231 0 R] эндобдж 165 0 объект [232 0 R 232 0 R 232 0 R 232 0 R 232 0 R 232 0 R 232 0 R 232 0 R 232 0 R 232 0 R 232 0 R 232 0 R 232 0 R 232 0 R 232 0 R 232 0 R 232 0 R 232 0 R 232 0 R 233 0 R 233 0 R 233 0 R 233 0 R 233 0 R 233 0 R 233 0 R 233 0 R 233 0 R 233 0 R 233 0 R 233 0 R 233 0 R 233 0 R 233 0 R 233 0 R 233 0 R 233 0 R 233 0 R 233 0 R 234 0 R 234 0 R 235 0 R 235 0 R 236 0 R 236 0 R 237 0 R 237 0 R 237 0 R 237 0 R 237 0 237 рандов 0 237 рандов 0 237 рандов 0 рандов] эндобдж 166 0 объект [238 0 R 238 0 R 238 0 R 238 0 R 238 0 R 238 0 R 238 0 R 238 0 R 238 0 R 238 0 R 238 0 R 238 0 R 239 0 R 239 0 R 240 0 R 240 0 R 240 0 R 240 0 R 240 0 R 240 0 R 240 0 R 240 0 R 240 0 R 240 0 R 240 0 R 240 0 R 240 0 R 240 0 R 240 0 R 240 0 R 240 0 R 240 0 R 240 0 R 240 0 R 241 0 R 241 0 R 242 0 R 242 0 R 242 0 R 242 0 R 242 0 R 242 0 R 242 0 R 242 0 R 242 0 R 242 0 R 242 0 R 242 0 R] эндобдж 167 0 объект [243 0 R 243 0 R 243 0 R 243 0 R 243 0 R 243 0 R 483 0 R 483 0 R 483 0 R 483 0 R 484 0 R 484 0 R 484 0 R 484 0 R 484 0 R 484 0 R 484 0 R 484 0 R 484 0 R 484 0 R 245 0 R 245 0 R 245 0 R 245 0 R 245 0 R 245 0 R 245 0 R 245 0 R 245 0 R 245 0 R 245 0 R 245 0 R 246 0 R 246 0 R 246 0 R 246 0 R 246 0 R 246 0 R 246 0 R 246 0 R 246 0 R 246 0 R 246 0 R 246 0 R 246 0 R 246 0 R 246 0 R 246 0 R] эндобдж 168 0 объект [247 0 R 247 0 R 247 0 R 247 0 R 247 0 R 247 0 R 248 0 R 248 0 R 248 0 R 248 0 R 248 0 R 248 0 R 248 0 R 248 0 R 248 0 R 248 0 R 248 0 R 248 0 R 249 0 R 249 0 R 249 0 R 249 0 R 249 0 R 249 0 R 249 0 R 249 0 R 249 0 R 249 0 R 249 0 R 249 0 R 250 0 R 250 0 R 251 0 R 251 0 R 251 0 R 251 0 R 251 0 R 251 0 R 251 0 R 251 0 R 251 0 R 251 0 R 251 0 R 251 0 R 251 0 R 251 0 R 251 0 R 251 0 R] эндобдж 169 0 объект [252 0 R 252 0 R 252 0 R 252 0 R 252 0 R 252 0 R 252 0 R 252 0 R 252 0 R 252 0 R 252 0 R 252 0 R 252 0 R 252 0 R 253 0 R 253 0 R 253 0 R 253 0 R 253 0 R 253 0 R 253 0 R 253 0 R 253 0 R 253 0 R 253 0 R 253 0 R 253 0 R 253 0 R 254 0 R 254 0 R 255 0 R 255 0 R 255 0 R 255 0 R 255 0 R 255 0 R 255 0 R 255 0 R 255 0 R 255 0 R 255 0 R 255 0 R 255 0 R 255 0 R 255 0 R 255 0 R 255 0 R 255 0 R] эндобдж 170 0 объект [256 0 R 256 0 R 257 0 R 257 0 R 257 0 R 257 0 R 257 0 R 257 0 R 257 0 R 257 0 R 257 0 R 257 0 R 258 ​​0 R 258 ​​0 R 259 0 R 259 0 R 259 0 259 р. 259 0 р 259 0 р 259 0 р 259 0 р 259 0 р 259 0 р 259 0 р 259 0 р 259 0 р 259 0 р 259 0 р 259 0 р 259 0 р 259 0 р 260 0 р 260 0 R 260 0 R 260 0 R 260 0 R 260 0 R 260 0 R 260 0 R 260 0 R 260 0 R 260 0 R 260 0 R 260 0 R 260 0 R 260 0 R 260 0 R] эндобдж 171 0 объект [261 0 R 261 0 R 261 0 R 261 0 R 261 0 R 261 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 262 0 R 263 0 R 263 0 R 264 0 R 264 0 R 264 0 R 264 0 R 264 0 R 264 0 R] эндобдж 172 0 объект [265 0 R 265 0 R 265 0 R 265 0 R 266 0 R 266 0 R 267 0 R 267 0 R 267 0 R 267 0 R 267 0 R 267 0 R 267 0 R 267 0 R 268 0 R 268 0 R 269 0 R 269 0 R 270 0 R 270 0 R 271 0 R 271 0 R 271 0 R 271 0 R 271 0 R 271 0 R 271 0 R 271 0 R 271 0 R 271 0 R 271 0 R 271 0 R 271 0 R 271 0 R 271 0 R 271 0 R 271 0 R 271 0 R 272 0 R 272 0 R 272 0 R 272 0 R 272 0 R 272 0 R 272 0 R 272 0 R 272 0 R 272 0 R 272 0 R 272 0 272 рандов 0 272 рандов 0 272 рандов 0 272 рандов] эндобдж 173 0 объект [273 0 R 273 0 R 273 0 R 273 0 R 273 0 R 273 0 R 273 0 R 273 0 R 273 0 R 273 0 R 273 0 R 273 0 R 273 0 R 273 0 R 273 0 R 273 0 R 274 0 R 274 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 275 0 R 276 0 R 276 0 R 276 0 R 276 0 R 276 0 R 276 0 R 276 0 R 276 0 276 р. 276 р. 0 276 р. 0 р. 276 0 р. 276 0 р. 276 0 р.] эндобдж 174 0 объект [277 0 R 277 0 R 277 0 R 277 0 R 277 0 R 277 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 278 0 R 279 0 R 279 0 R] эндобдж 175 0 объект [280 0 R 280 0 R 282 0 R 282 0 R 282 0 R 282 0 R 282 0 R 282 0 R 283 0 R 283 0 R 281 0 R] эндобдж 176 0 объект [284 0 R 284 0 R 286 0 R 286 0 R 286 0 R 286 0 R 286 0 R 286 0 R 287 0 R 287 0 R 288 0 R 288 0 R 288 0 R 288 0 R 288 0 R 288 0 R 288 0 288 р. 288 0 р. 288 0 р. 288 0 р. 288 0 р. 288 0 р. 288 0 р. 288 0 р. 288 0 р. 288 0 р. 288 0 р. 288 0 р. 285 0 р] эндобдж 177 0 объект [289 0 R 289 0 R 289 0 R 289 0 R 289 0 R 289 0 R 289 0 R 289 0 R 289 0 R 289 0 R 289 0 R 289 0 R 289 0 R 290 0 R 290 0 R 290 R 0 R 290 0 R 290 0 R 290 0 R 290 0 R 290 0 R 290 0 R 290 0 R 290 0 R 290 0 R 290 0 R 290 0 R 290 0 R 290 0 R 290 0 R 290 0 R 290 0 R 290 0 R 290 0 R 290 0 R 290 0 R 290 0 R 291 0 R 291 0 R 291 0 R 291 0 R 291 0 R 291 0 R 291 0 R 291 0 R 291 0 R 291 0 R 291 0 R 291 0 291 0 R 291 0 R] эндобдж 178 0 объект [292 0 R 292 0 R 292 0 R 292 0 R 293 0 R 293 0 R 294 0 R 294 0 R 294 0 R 294 0 R 294 0 R 294 0 R 294 0 R 294 0 R 294 0 R 294 0 R 294 0 R 294 0 R 294 0 R 294 0 R 294 0 R 294 0 R 294 0 R 294 0 R 294 0 R 294 0 R 295 0 R 295 0 R 296 0 R 296 0 R 298 0 R 298 0 R 298 0 R 298 0 R 299 0 R 299 0 R 300 0 R 300 0 R 300 0 R 300 0 R 297 0 R] эндобдж 179 0 объект [301 0 R 301 0 R 301 0 R 301 0 R 301 0 R 301 0 R 301 0 R 301 0 R 301 0 R 301 0 R 302 0 R 302 0 R 302 0 R 302 0 R 302 0 R 302 0 R 302 0 R 302 0 R 302 0 R 302 0 R 302 0 R 302 0 R 302 0 R 302 0 R 303 0 R 303 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 R 304 0 304 0 R 304 0 R 305 0 R 305 0 R] эндобдж 180 0 объект [306 0 R 306 0 R 308 0 R 308 0 R 308 0 R 308 0 R 308 0 R 308 0 R 308 0 R 308 0 R 308 0 R 308 0 R 308 0 R 308 0 R 309 0 R 309 0 R 307 0 R] эндобдж 181 0 объект [310 0 R 310 0 R 312 0 R 312 0 R 312 0 R 312 0 R 312 0 R 312 0 R 312 0 R 312 0 R 312 0 R 312 0 R 312 0 R 312 0 R 313 0 R 313 0 R 314 0 R 314 0 R 314 0 R 314 0 R 314 0 R 314 0 R 314 0 R 314 0 R 314 0 R 314 0 R 314 0 R 314 0 R 311 0 R] эндобдж 182 0 объект [315 0 R 315 0 R 315 0 R 315 0 R 315 0 R 315 0 R 315 0 R 315 0 R 315 0 R 315 0 R 315 0 R 315 0 R 315 0 R 315 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 316 0 R 317 0 R 317 0 R 318 0 R 318 0 R 485 0 R 486 0 R 487 0 R 488 0 489 0 R 490 0 R 491 0 R 492 0 R 493 0 R 494 0 R 495 0 R 496 0 R 497 0 R 498 0 R 499 0 R 500 0 R 501 0 R 502 0 R 503 0 R 504 0 R 505 0 R 506 0 R 507 0 R 508 0 R 509 0 R 510 0 R 511 0 R 512 0 R 513 0 R 514 0 R 515 0 R 516 0 R 517 0 R 518 0 R 519 0 R 520 0 R] эндобдж 183 0 объект [521 0 R 522 0 R 523 0 R 524 0 R 525 0 R 526 0 R 527 0 R 528 0 R 529 0 R 530 0 R 531 0 R 532 0 R 321 0 R 321 0 R 322 0 R 322 0 R 323 0 R 323 0 R 323 0 R 323 0 R 323 0 R 323 0 R 323 0 R 323 0 R 323 0 R 323 0 R 323 0 R 323 0 R 323 0 R 323 0 R 323 0 R 323 0 R 324 0 R 324 0 R 324 0 R 324 0 R 324 0 R 324 0 R 324 0 R 324 0 R 324 0 R 324 0 R 324 0 R 324 0 R 324 0 R 324 0 R 324 0 R 324 0 R 324 0 R 324 0 324 0 R 324 0 R 324 0 R 324 0 R 324 0 R 324 0 R 325 0 R 325 0 R 326 0 R 326 0 R 326 0 R 326 0 R 326 0 R 326 0 R 326 0 R 326 0 R 326 0 326 р. 0 326 р. 0 326 р.] эндобдж 184 0 объект [327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 327 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R 328 0 R] эндобдж 185 0 объект [329 0 R 329 0 R 329 0 R 329 0 R 329 0 R 329 0 R 329 0 R 329 0 R 329 0 R 329 0 R 329 0 R 329 0 R 329 0 R 329 0 R 329 0 R 329 0 R 329 0 R 329 0 R 329 0 R 329 0 R 330 0 R 330 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 R 331 0 331 0 R 331 0 R 331 0 R] эндобдж 186 0 объект [332 0 R 332 0 R 333 0 R 333 0 R 334 0 R 334 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R 335 0 R] эндобдж 187 0 объект [336 0 R 336 0 R 336 0 R 336 0 R 336 0 R 336 0 R 336 0 R 336 0 R 336 0 R 336 0 R 336 0 R 336 0 R 336 0 R 337 0 R 337 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R 338 0 R] эндобдж 188 0 объект [339 0 R 339 0 R 339 0 R 339 0 R 339 0 R 339 0 R 339 0 R 339 0 R 339 0 R 340 0 R 341 0 R 341 0 R 343 0 R 343 0 R 343 0 R 343 R 0 343 р. 343 0 р. 343 0 р. 343 0 р. 343 0 р. 343 0 р. 344 0 р. 344 0 р. 342 0 р.] эндобдж 189 0 объект [345 0 R 345 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 346 0 R 347 0 R 347 0 R] эндобдж 190 0 объект [348 0 R 348 0 R 350 0 R 350 0 R 350 0 R 350 0 R 350 0 R 350 0 R 350 0 R 350 0 R 350 0 R 350 0 R 351 0 R 351 0 R 352 0 R 352 0 R 352 0 R 353 0 R 353 0 R 353 0 R 353 0 R 353 0 R 353 0 R 353 0 R 353 0 R 353 0 R 353 0 R 353 0 R 353 0 R 353 0 R 353 0 R 353 0 R 353 0 R 353 0 R 353 0 R 353 0 R 353 0 R 349 ​​0 R] эндобдж 191 0 объект [354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 354 0 R 355 0 R 355 0 R 356 0 R 356 0 R 533 0 R 534 0 R 535 0 R 536 0 R 537 0 538 руб. 0 руб. 539 0 руб. 540 0 руб. 541 0 руб. 542 0 руб. 543 0 руб. 544 0 руб. 545 0 руб. 0 R 555 0 R 556 0 R 557 0 R 558 0 R 559 0 R 560 0 R 561 0 R 562 0 R 563 0 R 564 0 R 565 0 R 566 0 R 567 0 R 568 0 R 569 0 R 570 0 R 571 0 R 572 0 R] эндобдж 192 0 объект [573 0 R 574 0 R 575 0 R 576 0 R 577 0 R 578 0 R 579 0 R 580 0 R 581 0 R 582 0 R 583 0 R 584 0 R 585 0 R 586 0 R 587 0 R 588 0 R 589 0 R 590 0 R 591 0 R 592 0 R 593 0 R 594 0 R 595 0 R 596 0 R 597 0 R 598 0 R 599 0 R 600 0 R 601 0 R 602 0 R 603 0 R 604 0 R 605 0 R 606 0 R 607 0 R 608 0 R 609 0 R 610 0 R 611 0 R 612 0 R 613 0 R 614 0 R 615 0 R 616 0 R 617 0 R 618 0 R 619 0 R 620 0 R 621 0 R 622 0 623 0 R 624 0 R 625 0 R 626 0 R 627 0 R 628 0 R 629 0 R 630 0 R 631 0 R 632 0 R 633 0 R 359 0 R 359 0 R 360 0 R 360 0 R 361 0 R 361 0 R 361 0 R 361 0 R 361 0 R 361 0 R 361 0 R 361 0 R 361 0 R 361 0 R 361 0 R 361 0 R 361 0 R 361 0 R 361 0 R 361 0 R 362 0 R 362 0 R 362 0 R 362 0 R 362 0 R 362 0 R 362 0 R 362 0 R 362 0 R 362 0 R 362 0 R 362 0 R 362 0 R 362 0 R 362 0 R] эндобдж 193 0 объект [363 0 R 363 0 R 363 0 R 363 0 R 363 0 R 363 0 R 363 0 R 363 0 R 363 0 R 363 0 R 363 0 R 363 0 R 363 0 R 363 0 R 363 0 R 363 0 R 363 0 R 363 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R 364 0 R] эндобдж 194 0 объект [365 0 R 365 0 R 365 0 R 365 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 366 0 R 367 0 R 367 0 R 367 0 R 367 0 R 367 0 R 367 0 R 367 0 R 367 0 R 367 0 367 0 R 367 0 R 367 0 R] эндобдж 195 0 объект [368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 368 0 R 369 0 R 369 0 R] эндобдж 196 0 объект [370 0 R 370 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 372 0 R 372 0 R 373 0 R 373 0 R 374 0 R 374 0 R 375 0 R 375 0 R 375 0 R 375 0 R 375 0 R 375 0 R 376 0 R 376 0 R 377 0 R 377 0 R 378 0 R 378 0 R 379 0 R 379 0 R 379 0 R 379 0 R] эндобдж 197 0 объект [380 0 R 380 0 R 381 0 R 381 0 R 382 0 R 382 0 R 383 0 R 383 0 R 384 0 R 384 0 R 385 0 R 385 0 R 385 0 R 385 0 R 385 0 R 385 0 R 385 0 R 385 0 R 386 0 R 386 0 R 387 0 R 387 0 R 387 0 R 387 0 R 387 0 R 387 0 R 387 0 R 387 0 R 387 0 R 387 0 R 388 0 R 388 0 R 389 0 R 389 0 R 390 0 R 390 0 R 390 0 R 390 0 R 391 0 R 391 0 R 391 0 R 391 0 R 392 0 R 392 0 R 392 0 R 392 0 R 393 0 R 393 0 R] эндобдж 198 0 объект [394 0 R 394 0 R 395 0 R 395 0 R 395 0 R 395 0 R 396 0 R 396 0 R 396 0 R 396 0 R 396 0 R 396 0 R 397 0 R 397 0 R 397 0 R 397 0 R 397 0 R 397 0 R 398 0 R 398 0 R 398 0 R 398 0 R 398 0 R 398 0 R 398 0 R 398 0 R 399 0 R 399 0 R 399 0 R 399 0 R 399 0 R 399 0 R 399 0 R 399 0 R 400 0 R 400 0 R 400 0 R 400 0 R 401 0 R 401 0 R 401 0 R 401 0 R 402 0 R 402 0 R 402 0 R 402 0 R 402 0 R 402 0 R] эндобдж 199 0 объект [403 0 R 403 0 R 403 0 R 403 0 R 403 0 R 403 0 R 404 0 R 404 0 R 404 0 R 404 0 R 405 0 R 405 0 R 405 0 R 405 0 R 405 0 R 405 0 R 406 0 R 406 0 R 406 0 R 406 0 R 407 0 R 407 0 R 407 0 R 407 0 R 407 0 R 407 0 R 408 0 R 408 0 R 408 0 R 408 0 R 409 0 R 409 0 R 409 0 R 409 0 R 410 0 R 410 0 R 410 0 R 410 0 R 410 0 R 410 0 R 410 0 R 410 0 R 411 0 R 411 0 R 411 0 R 411 0 R 411 0 R 411 0 R] эндобдж 200 0 объект [412 0 R 412 0 R 412 0 R 412 0 R 413 0 R 414 0 R 414 0 R 414 0 R 414 0 R 414 0 R 415 0 R 415 0 R 415 0 R 415 0 R 415 0 R 415 0 R 415 0 R 415 0 R 416 0 R 416 0 R 416 0 R 416 0 R 417 0 R 417 0 R 417 0 R 417 0 R 417 0 R 417 0 R 418 0 R 418 0 R 418 0 R 418 0 R 419 0 R 419 0 R 419 0 R 419 0 R 420 0 R 420 0 R 420 0 R 420 0 R 420 0 R 420 0 R 420 0 R 421 0 R 421 0 R] эндобдж 201 0 объект [422 0 R 422 0 R 422 0 R 422 0 R 423 0 R 423 0 R 423 0 R 423 0 R 424 0 R 424 0 R 424 0 R 424 0 R 425 0 R 425 0 R 425 0 R 425 0 R 426 0 R 426 0 R 426 0 R 426 0 R 426 0 R 426 0 R 427 0 R 427 0 R 428 0 R 428 0 R 428 0 R 428 0 R 429 0 R 429 0 R 429 0 R 429 0 R 429 0 R 429 0 R 430 0 R 430 0 R 430 0 R 430 0 R 430 0 R 430 0 R 431 0 R 431 0 R 431 0 R 431 0 R 431 0 R 431 0 R 432 0 R 432 0 R] эндобдж 202 0 объект [433 0 R 433 0 R 434 0 R 434 0 R 434 0 R 434 0 R 435 0 R 435 0 R 435 0 R 435 0 R 436 0 R 436 0 R 436 0 R 436 0 R 436 0 R 436 0 R 437 0 R 437 0 R 437 0 R 437 0 R 438 0 R 438 0 R 438 0 R 438 0 R 439 0 R 439 0 R 439 0 R 439 0 R 439 0 R 439 0 R 439 0 R 440 0 R 440 0 R 440 0 R 440 0 R 440 0 R 440 0 R 441 0 R 441 0 R 441 0 R 441 0 R 441 0 R 441 0 R 442 0 R 442 0 R 442 0 R 442 0 R] эндобдж 203 0 объект [443 0 R 443 0 R 444 0 R 444 0 R 444 0 R 444 0 R 444 0 R 444 0 R 445 0 R 445 0 R 445 0 R 445 0 R 446 0 R 446 0 R 446 0 R 446 0 R 446 0 R 446 0 R 447 0 R 447 0 R 447 0 R 447 0 R 447 0 R 447 0 R 448 0 R 448 0 R 448 0 R 448 0 R 448 0 R 448 0 R 449 0 R 449 0 R 449 0 R 449 0 R 449 0 R 449 0 R 450 0 R 450 0 R 450 0 R 450 0 R 450 0 R 450 0 R 451 0 R 451 0 R 451 0 R 451 0 R 451 0 R 451 0 R] эндобдж 204 0 объект [452 0 R 452 0 R 452 0 R 452 0 R 453 0 R 453 0 R 453 0 R 453 0 R 453 0 R 453 0 R 453 0 R 454 0 R 454 0 R 454 0 R 454 0 R 455 0 R 455 0 R 455 0 R 455 0 R 456 0 R 456 0 R 456 0 R 456 0 R 457 0 R 457 0 R 457 0 R 457 0 R 458 0 R 458 0 R 458 0 R 458 0 R 458 0 R 458 0 R 459 0 R 459 0 R 459 0 R 459 0 R 460 0 R 460 0 R 460 0 R 460 0 R 461 0 R 461 0 R 462 0 R 462 0 R 462 0 R 462 0 R 462 0 R] эндобдж 205 0 объект [463 0 R 463 0 R 463 0 R 463 0 R 464 0 R 464 0 R 464 0 R 464 0 R 464 0 R 464 0 R 465 0 R 465 0 R 465 0 R 465 0 R 465 0 R 465 0 R 466 0 R 466 0 R 466 0 R 466 0 R 466 0 R 466 0 R 467 0 R 467 0 R 467 0 R 467 0 R 467 0 R 467 0 R 468 0 R 468 0 R 468 0 R 468 0 R 469 0 R 469 0 R 469 0 R 469 0 R 469 0 R 469 0 R 470 0 R 470 0 R 470 0 R 470 0 R 471 0 R 471 0 R 471 0 R 471 0 R 471 0 R 471 0 R] эндобдж 206 0 объект [472 0 R 472 0 R 472 0 R 472 0 R 473 0 R 473 0 R 473 0 R 473 0 R 474 0 R 474 0 R 474 0 R 474 0 R 475 0 R 475 0 R 475 0 R 475 0 R 475 0 R 475 0 R 476 0 R 476 0 R 476 0 R 476 0 R 476 0 R 476 0 R 477 0 R 477 0 R 477 0 R 477 0 R 477 0 R 477 0 R 478 0 R 478 0 R 478 0 R 478 0 R 479 0 R 479 0 R 479 0 R 479 0 R 479 0 R 479 0 R 480 0 R 480 0 R 480 0 R 480 0 R 480 0 R 480 0 R 480 0 R 480 0 R] эндобдж 207 0 объект [481 0 R 481 0 R 481 0 R 481 0 R 482 0 R 482 0 R] эндобдж 481 0 объект > эндобдж 482 0 объект > эндобдж 57 0 объект > эндобдж 54 0 объект > / MediaBox [0 0 595.25 842] / Parent 3 0 R / Resources> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] >> / StructParents 45 / Tabs / S / Type / Page >> эндобдж 816 0 объект [820 0 R] эндобдж 817 0 объект > поток HVmo6.`> JCL {H˶ # lbeHD˿ ߑ b: qv

    % PDF-1.7 % 853 0 объект > эндобдж xref 853 76 0000000016 00000 н. 0000003183 00000 п. 0000003364 00000 н. 0000004259 00000 н. 0000004691 00000 н. 0000004718 00000 н. 0000005158 00000 н. 0000005414 00000 н. 0000006112 00000 п. 0000006361 00000 п. 0000006475 00000 н. 0000006587 00000 н. 0000006723 00000 н. 0000007146 00000 н. 0000007610 00000 п. 0000008409 00000 н. 0000009390 00000 н. 0000009522 00000 н. 0000009916 00000 н. 0000010579 00000 п. 0000010606 00000 п. 0000011641 00000 п. 0000012713 00000 п. 0000013098 00000 п. 0000013125 00000 п. 0000013271 00000 п. 0000013669 00000 п. 0000013945 00000 п. 0000014567 00000 п. 0000015566 00000 п. 0000015979 00000 п. 0000016258 00000 п. 0000016405 00000 п. 0000016432 00000 п. 0000017193 00000 п. 0000017610 00000 п. 0000018525 00000 п. 0000019272 00000 п. 0000020042 00000 н. 0000020660 00000 п. 0000020985 00000 п. 0000021259 00000 п. 0000029354 00000 п. 0000029450 00000 п. 0000029520 00000 н. 0000029590 00000 н. 0000029726 00000 п. 0000030015 00000 п. 0000030305 00000 п. 0000043774 00000 п. 0000043877 00000 п. 0000043947 00000 п. 0000098916 00000 п. 0000099206 00000 н. 0000099740 00000 п. 0000100003 00000 н. 0000139435 00000 н. 0000139550 00000 н. 0000139620 00000 н. 0000160786 00000 н. 0000161409 00000 н. 0000183325 00000 н. 0000207405 00000 н. 0000253894 00000 н. 0000263079 00000 п. 0000263339 00000 н. 0000263749 00000 н. 0000283863 00000 н. 0000284126 00000 н. 0000284494 00000 н. 0000284884 00000 н. 0000285340 00000 н. 0000285789 00000 н. 0000286264 00000 н. 0000002985 00000 н. 0000001816 00000 н. трейлер ] / Назад 3717520 / XRefStm 2985 >> startxref 0 %% EOF 928 0 объект > поток hb``b` €

    Объем рынка красок и покрытий, отчет об анализе долей и тенденций по продуктам, материалам, областям применения и прогнозам по сегментам, 2020

    Нью-Йорк, сент.09, 2020 (GLOBE NEWSWIRE) - Reportlinker.com объявляет о выпуске отчета «Объем рынка красок и покрытий, отчет об анализе долей и тенденций по продуктам, материалам, областям применения и прогнозам по сегментам, 2020–2027 годы» - https: / /www.reportlinker.com/p05965079/?utm_source=GNW

    Рост и тенденции рынка красок и покрытий

    Ожидается, что к 2027 году объем мирового рынка красок и покрытий достигнет 202,7 млрд долларов США, при этом CAGR составит 4,3% по сравнению с прогнозный период.Ожидается, что рынок станет свидетелем значительного роста в странах с развивающейся экономикой, таких как Индия, Китай и Индонезия. Этот рост объясняется бумом в мировой строительной отрасли и растущим спросом на краски и покрытия для товаров длительного пользования, автомобилей и промышленных предприятий.

    Ожидается, что в течение прогнозируемого периода спрос на краски и покрытия на водной основе вырастет из-за различных нормативных актов, касающихся ЛОС и опасных загрязнителей воздуха (HAP), а также повышения осведомленности о неблагоприятных последствиях красок и покрытий на основе растворителей.Набор правил, применимых к производству красок и покрытий, очень строг из-за канцерогенных и легковоспламеняющихся свойств растворителей.

    Таким образом, ожидается, что в прогнозируемом периоде не содержащие летучих органических соединений порошковые покрытия и покрытия на водной основе будут иметь высокий спрос. Мировой рынок движется к крупным консолидациям, чтобы повысить эффективность, поддержать рост и добиться большего влияния на поставщиков и клиентов.

    Консолидация рынка стала долгосрочной тенденцией, особенно на западном рынке, с ограниченным органическим ростом.Например, рынок в Америке консолидируется на протяжении десятилетий, и ключевые игроки участвуют в слияниях и поглощениях, чтобы дополнить устойчивый органический рост и повысить эффективность за счет масштабирования или улучшения процессов.

    Недавние сделки, такие как слияние компаний Sherwin-Williams и Valspar Corporation и слияние Nippon Paint Holdings Co., Ltd. и Dunn-Edwards Corp., отражают продолжающуюся тенденцию к консолидации отрасли на западном рынке.

    Обзор рынка красок и покрытий
    • Мировой рынок оценивался в 146 долларов США.2 млрд в 2019 году и, по оценкам, будет расти в среднем на 4,3% с 2020 по 2027 год
    • Ожидается, что в сегменте полиуретановых материалов будет самый высокий среднегодовой темп роста в 5,3% за прогнозируемый период
    • Значительный среднегодовой темп роста объясняется отличной производительностью полиуретановые материалы при экстремальных температурах и различных условиях окружающей среды наряду с широким использованием в конструкционной стали, напольных покрытиях и кровлях, покрытиях кузовов грузовиков, судостроении
    • На архитектурно-декоративный сегмент пришлась самая высокая доля доходов в 2019 году, и он будет расширяться и дальше со стабильным среднегодовым темпом роста с 2020 по 2027 год
    • На долю Китая приходилось более 17.7% от общей выручки в 2019 году. Ожидается, что рост числа проектов по развитию инфраструктуры и рост обрабатывающей промышленности в стране будут стимулировать региональный рынок в течение прогнозируемого периода.
    Прочтите полный отчет: https://www.reportlinker.com / p05965079 /? utm_source = GNW

    О Reportlinker
    ReportLinker - это отмеченное наградами решение для исследования рынка. Reportlinker находит и систематизирует самые свежие отраслевые данные, чтобы вы могли мгновенно получать все необходимые исследования рынка в одном месте.

    __________________________

     

    Страница не найдена | КУЛЬТУРА ЗИМА

    Похоже, здесь ничего не было найдено. Может быть, попробуйте поискать или по одной из ссылок ниже?

    Архивы Выберите месяц Февраль 2021 Декабрь 2020 Ноябрь 2020 Октябрь 2020 Сентябрь 2020 Июль 2020 Июнь 2020 Май 2020 Апрель 2020 Март 2020 Февраль 2020 Январь 2020 Декабрь 2019 Ноябрь 2019 Октябрь 2019 Сентябрь 2019 Август 2019 Июль 2019 Июнь 2019 Май 2019 Апрель 2019 Март 2019 Февраль 2019 Январь 2019 Декабрь 2018 Ноябрь 2018 Октябрь 2018 Сентябрь 2018 Август 2018 Июль 2018 Июнь 2018 Май 2018 Апрель 2018 Март 2018 Февраль 2018 Январь 2018 Декабрь 2017 Ноябрь 2017 Октябрь 2017 Сентябрь 2017 Август 2017 Июль 2017 Июнь 2017 Май 2017 Апрель 2017 Март 2017 Февраль 2017 Январь 2017 Декабрь 2016 Ноябрь 2016 октябрь 2016 сентябрь 2016 август 2016 июль 2016 июнь 2016 май 2016 апрель 2016 март 2016 январь 2016 декабрь 2015 ноябрь 2015 октябрь 2015 сентябрь 2015 август 2015 июль 2015 июнь 2015 май 2015 апрель 2015 март 2015 февраль 2015 январь 2015 декабрь 2014 ноябрь 2014 октябрь 2014 Septembe r 2014 август 2014 июль 2014 июнь 2014 май 2014 апрель 2014 март 2014 февраль 2014 январь 2014 декабрь 2013 ноябрь 2013 октябрь 2013 сентябрь 2013 август 2013 июль 2013 июнь 2013 май 2013 апрель 2013 март 2013 февраль 2013 январь 2013 декабрь 2012 ноябрь 2012 октябрь 2012 сентябрь 2012 Август 2012 Июль 2012 Июнь 2012 Май 2012 Апрель 2012 Март 2012 Февраль 2012 Январь 2012 Декабрь 2011 Ноябрь 2011 Октябрь 2011 Сентябрь 2011 Август 2011 Июль 2011 Июнь 2011 Май 2011 Апрель 2011 Март 2011 Февраль 2011 Январь 2011 Декабрь 2010 Ноябрь 2010 Октябрь 2010 Сентябрь 2010 Сентябрь 2010 Август 2010 Июль 2010 июнь 2010 май 2010 апрель 2010 март 2010 февраль 2010 январь 2010 декабрь 2009 ноябрь 2009 октябрь 2009 сентябрь 2009 август 2009 июль 2009 июнь 2009 май 2009 апрель 2009 март 2009

    CategoriesSelect CategoryAllArchitectureArtArts и CultureArts Финансирование и DevelopmentBeautyBig IdeaBooksBooksCity ConversationsCity CultureCity VoicesClassicalClubsComedyCommunityDanceDementia FriendlyDiaryDigital & DesignEating OutEditorialElectronicaEventExhibitionsFamilyFeaturedFestivalsFictionFilmFolkFood & DrinkHandmade TalesHappeningsIdentityLeeds International FestivalLeeds Young Film FestivalLifestyle ChoicesMagazinesMiscellaneousMusicMusicalOperaPerformancePet SoundsPhotographyPodcastsPoetryProvocationsPublic ArtReviewsRockScalaramaSculptureSLANTSpeaker в CornerSportsStorytellingStudioStyleTelevisionTheatreTransform19TravelWalking HistoriesWellbeing

    Бактериальное разнообразие и функциональные свойства у особей, содержащихся в неволе

    Abstract

    Во всем мире численность птиц-падальщиков, таких как стервятники и кондоры, резко сокращается.Птицы-падальщики имеют особый пищеварительный процесс, позволяющий справляться с большим количеством бактерий в их основном рационе, состоящем из тушек с разной степенью разложения. Эти наблюдения побуждают нас представить анализ микробиомов здоровых калифорнийских кондоров ( Gymnogyps californianus ) в неволе, чтобы охарактеризовать популяцию, выросшую вместе в аналогичных условиях. Метагеномные последовательности ДНК дробовика были проанализированы в образцах фекалий и клоаки птиц, содержащихся в неволе. Классификация данных последовательности ДНК дробовика с помощью пептидных сигнатур с использованием пакета Sequedex предоставила как филогенетические, так и функциональные профили, а также индивидуально аннотированные чтения для целевого подтверждающего анализа.Мы наблюдали виды бактерий, ранее ассоциированные с птицами и микробиомами кишечника, включая как вирулентные, так и условно-патогенные микроорганизмы, такие как Clostridium perfringens , Propionibacterium acnes , Shigella flexneri и Fusobacterium mortiferum , обычную флору, такую ​​как Lactobacillus john. Lactobacillus ruminus и Bacteroides vulgatus , а также микробы слизистой оболочки, такие как Delftia acidovorans , Stenotrophomonas maltophilia и Corynebacterium falsnii .Классификация с использованием метагеномных считываний генов филогенетических маркеров с использованием дробовика соответствовала анализу, основанному на данных 16S рДНК, и более специфична. Классификация образцов на основе филогенетических или функциональных профилей геномных фрагментов позволила дифференцировать три типа образцов: фекальные, зрелые клоаки и незрелые клоаки, причем неполовозрелые птицы имеют примерно на 40% большее разнообразие микробов.

    Образец цитирования: Jacobs L, McMahon BH, Berendzen J, Longmire J, Gleasner C, Hengartner NW, et al.(2019) Микробиомы калифорнийских кондоров: разнообразие бактерий и функциональные свойства у разводимых в неволе особей. PLoS ONE 14 (12): e0225858. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225858

    Редактор: Сюзанна Л. Исхак, Университет штата Мэн, США

    Поступила: 25 июня 2019 г .; Одобрена: 13 ноября 2019 г .; Опубликован: 11 декабря 2019 г.

    Авторские права: © 2019 Jacobs et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Доступность данных: Файлы данных последовательностей депонированы в архиве считывания последовательностей под номером биопроекта PRJNA297579. Исходный код sequedex доступен по адресу https://github.com/lanl/sequedex-core, а исполняемый выпуск с модулями данных доступен по адресу https://github.com/Sequedex/Sequedex-build/releases. /tag/v2.r20181211. Документация для пакета sequedex доступна по адресу https://sequedex.readthedocs.io/en/latest/.

    Финансирование: Авторы благодарят Программу исследований и разработок Национальной лаборатории Лос-Аламоса и Центр космических и земных наук за единственное финансирование всего этого исследования.ООО «Триада национальной безопасности» является оператором Лос-Аламосской национальной лаборатории (ЛАНЛ) по контракту № 89233218CNA000001 в Министерстве энергетики США. Все авторы, кроме MJ из Peregrine Fund, который не финансировался, финансировались Лос-Аламосской национальной лабораторией. MV и JB были в Лос-Аламосской национальной лаборатории для выполнения всех частей своего вклада, и у них есть текущие адреса для их новых рабочих организаций. Фонд Лос-Аламосской национальной лаборатории предоставил поддержку в виде заработной платы всем авторам, за исключением MJ из Peregrine Fund, но не сыграл никакой дополнительной роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. .Конкретные роли всех авторов сформулированы в разделе «Авторский вклад».

    Конкурирующие интересы: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении публикации этой статьи. Все работы были завершены и профинансированы Лос-Аламосской национальной лабораторией. Два автора (MV и JB) с тех пор покинули Лос-Аламосскую национальную лабораторию и их новые коммерческие филиалы, и это не влияет на нашу приверженность политике PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

    Введение

    Калифорнийский кондор ( Gymnogyps californianus ) - это вид, который резко сократился в течение 20–90–137-го века в результате браконьерства, отравления свинцом и изменений среды обитания [1]. В 1987 году последние оставшиеся особи были пойманы в дикой природе для участия в программе разведения. Эта программа разведения оказалась успешной, и в 1992 году небольшое количество кондоров было повторно введено в дикую природу. Сегодня более 500 калифорнийских кондоров живут в дикой природе или в неволе.Однако у современных калифорнийских кондоров меньше генетического разнообразия, потому что резкое сокращение численности кондоров в 20 - веках также привело к сокращению генетического разнообразия на 80% [2]. Это отсутствие генетического разнообразия может иметь последствия для здоровья, эффекты, которые могут быть усилены потенциально патогенными инфекционными заболеваниями, которым калифорнийские кондоры подвергаются в дикой природе [3]. Из-за этих потенциальных факторов, влияющих на здоровье кондоров, индикаторы здоровья кондоров как в неволе, так и в дикой природе представляют большой интерес для оценки здоровья и состояния как населения, так и отдельных лиц.

    Микробиом (совокупный геном видов микробов в образце) может быть хорошим индикатором здоровья и состояния у видов птиц [4]. Микробиота кишечника влияет на здоровье и физиологию позвоночных, указывая на то, что факторы стресса, с которыми сталкиваются кондоры, можно оценить с помощью микробиоты кишечника [5]. Например, состояние нижней части тела птенцов большой синицы ( Parus major) коррелирует с большими сдвигами в микробном разнообразии и составе [6]. Метагеномное профилирование микробных сообществ уже применялось для получения филогенетической и функциональной информации для образцов окружающей среды [7], диких животных [8], домашних животных [9] и исчезающих видов [10, 11].Существуют подробные обзоры микробиома птиц, которые могут быть использованы в усилиях по сохранению таких видов птиц, как калифорнийский кондор [4, 5, 12]. В рамках усилий по сохранению любого вида микробиом здоровых животных в неволе станет ценным ресурсом для сравнения с микробными данными по диким особям того же вида [13].

    Образ жизни птиц отличается от образа жизни многих животных, что позволяет предположить, что роль бактерий в микробиоме птиц может отличаться от того, что обычно наблюдается.Это особенно верно для птиц-падальщиков, таких как стервятники, у которых в изобилии были обнаружены патогены человека, живущие рядом с ними [14]. Считается, что стервятники переносят эти потенциально патогенные бактерии, чтобы получать пользу от бактериального расщепления падали [15, 16]. Чтобы безопасно переваривать вредные бактерии, попавшие в их основной рацион, состоящий из туш с различными уровнями разложения, птицы-падальщики, такие как стервятники и кондоры, имеют чрезвычайно кислую пищеварительную систему (1,9 pH у стервятников по сравнению с 2.9 pH у человека) [17, 18]. Признаки здоровья у птиц-падальщиков могут значительно отличаться от других видов птиц из-за этой пищеварительной адаптации, и анализ микробиома репрезентативных здоровых птиц-падальщиков будет необходим для полезного сравнения с дикими особями.

    Однако в недавних исследованиях все чаще отмечается влияние неволи на микробиом животных [19, 20]. Это особенно верно, если на микробиом кишечника могут повлиять изменения в рационе диких аналогов [21].Кроме того, подчеркивается важность изучения микробиома дикой природы с эволюционной точки зрения [22]. Несмотря на эти проблемы и до того, как будут доступны образцы от диких кондоров, необходимо оценить исходную изменчивость и разнообразие микробиомных сообществ содержащихся в неволе кондоров. Было показано, что у птиц микробиом растущих цыплят и птенцов как увеличил, так и уменьшил микробное разнообразие [6, 23–26]. Эти данные подчеркивают важность поиска исходных условий для калифорнийских кондоров.

    Успехи в сигнатурном анализе геномных данных демонстрируют способность быстро извлекать филогенетическую и функциональную информацию из данных метагеномики дробовика [12]. По сравнению с подходом к секвенированию 16S рДНК, метагеномика дробовика позволяет анализировать бактериальное разнообразие в образцах, а также предоставляет информацию о присутствии грибковых, паразитарных и ДНК-вирусных патогенов [27]. Кроме того, секвенирование гена 16S рДНК, предоставляя экономичный и хорошо понятный метод исследования филогенетического состава микробных сообществ, не дает информации о метаболических путях или паттернах устойчивости к противомикробным препаратам.Метагеномное секвенирование с дробовиком обещает выявить гены устойчивости, их точечные мутации и другие функциональные изменения генов, которые могут идентифицировать такие события, как воздействие свинцовых загрязнителей. В этой работе мы применяем пакет анализа метагеномики Sequedex [28], чтобы продемонстрировать анализ этих характеристик на данных микробиома калифорнийских кондоров. Кроме того, мы сравниваем 16S рДНК и секвенирование метагеномики дробовика в показателях микробного состава и микробного разнообразия.

    Цели нашего исследования двоякие.Первая цель - описать микробиом здоровых калифорнийских кондоров разного возраста в неволе, чтобы охарактеризовать индивидуальные различия в структуре микробного сообщества и бактериальных генах в аналогичной среде. Содержащиеся в неволе особи кондоров разного возраста дают возможность проверить, увеличивается или уменьшается разнообразие микробных сообществ с возрастом. Наша вторая цель - сравнить подход к секвенированию 16S рДНК с дробовиком метагеномного секвенирования микробиома кондора.Данные о содержащихся в неволе калифорнийских кондоров могут быть использованы в качестве основы для будущего сравнения изменчивости и разнообразия микробиома с микробиомами диких калифорнийских кондоров.

    Результаты

    Двадцать видов бактерий составили 89% бактерий, идентифицированных в микробиомах здоровых калифорнийских кондоров, содержащихся в неволе (Таблица 1). Все эти бактерии ранее были связаны с птицами и / или микробиомами кишечника (например, см. Ballou 2016, Larsen 2015, Prabhakar 2012, Vela 2015 и Vital 2014).Для большинства образцов было получено ~ 30 000 считываний рДНК, в то время как выход последовательного секвенирования составил 10-15 миллионов считываний на образец. От 4 до 58% метагеномных считываний дробовика были идентифицированы как бактериальные при анализе с помощью Sequedex, с 40% типичными для образцов фекалий. В образцах клоаки был больший разброс в процентах распознанных прочтений из-за вариабельности количества присутствующей ДНК кондора. ДНК Condor содержит гораздо меньшую долю кодирующей ДНК, чем бактерии, и, следовательно, имеет меньшую долю считываний, которые были распознаны сигнатурами пептидов в Sequedex.

    Таблица 1. Характеристики собранных образцов фекалий и клоаки.

    Метагеномное секвенирование как 16S, так и ДНК было выполнено на большинстве образцов. Два наиболее распространенных вида указаны для каждого человека в таблице 1. Доминирующие виды, приписываемые метагеномике ДНК-дробовика: Cje = Corynebacterium jeikeium , Pac = Propionibacterium acnes , Sfl = Shigella flexneri , Cpe = Clostridium perfringens , Fva = Fusobacterium varium , Bov = Bacteroides ovatus , Ckr = Corynebacterium kroppenstedtii , Eco = Escherichia coli , Sps = Staphylococcus pseudintermedius , Sps = Staphylococcus pseudintermedius , Acidibacns = Dalphintermedius , , Cul = Corynebacterium ulcerans , Bsu = Brevundimonas subvibrioides , Esp = Enterococcus sp ., Sma = Stenotrophomonas maltophilia , Ljo = Lactobacillus johnsonii , Fmo = Fusobacterium mortiferum , Pan = Peptostreptococcus anaerobius , Csp = Clostridium sp ., Celovum .

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225858.t001

    Микробный состав

    Как описано в документации Sequedex (https: // sequedex.readthedocs.io/en/latest/) и показано на S1 Fig, каждое чтение, распознаваемое Sequedex, помещается в узел филогенетического дерева в соответствии с сигнатурными пептидами, содержащимися в этом чтении. Показанные образцы назначенных считываний типичны для отдельных видов, причем считывания сосредоточены в линии от корня дерева к листьям. Эта закономерность возникает из-за того, что считывание 151 пары оснований содержит только ограниченное количество филогенетической информации, причем некоторые считывания специально идентифицируются около листьев дерева, а другие более неоднозначно идентифицируют организмы образца.Однако все эти чтения следует подсчитывать для оценки относительной численности различных филогенетических категорий, обнаруженных в образце.

    S1 Фиг. Показывает филогенетическое распределение считываний Sequedex для многочисленных таксонов в четырех областях дерева, с более чем 100 000 прочтений, присвоенных в каждом из приведенных примеров. Каждый из показанных примеров согласуется с присутствием одного вида в этой области филогенетического дерева, с примером Lactobacillus , типичным для близкого совпадения с двумя близкородственными видами в справочной базе данных, и с Clostridium sp .пример, совместимый с близким соответствием эталонному организму ( C . perfringens в данном случае), который отличается от других организмов в эталонной базе данных. Примеры как Fusobacterium , так и Propionibacterium являются более неоднозначными, отражая либо смесь родственных организмов, либо новый организм с инвентаризацией генома, полученной от нескольких эталонных организмов.

    Разнообразие Симпсона внутри выборки, основанное на считываниях, свёрнутых по типам, значительно различается между тремя группами (ANOVA: F 2,27 = 19.41, P <0,001; Рис. 1) и был самым высоким в образцах клоаки молодых птиц («Клоака, неполовозрелые», Рис. 1). Зрелая клоака имела наименьшее разнообразие. Апостериорные тесты показывают, что все три группы значительно отличаются друг от друга (апостериорный тест Тьюки: все значения p <0,05). В образцах незрелой клоаки присутствуют различные бактерии, представляющие роды Corynebacterium , Shigella , Fusobacterium и Staphylococcus . В зрелых образцах клоаки доминировал один организм - Delftia acidovorans . Clostridium и Fusobacterium были обычными родами в образцах фекалий, хотя один образец состоял преимущественно из Bacteroidetes и Shigella .

    Рис. 1. Гистограмма с накоплением относительной численности бактериального состава каждого из образцов показана для выбранных типов, указанных справа от рис.

    Преобладающие виды, составляющие каждый тип, показаны на столбчатой ​​диаграмме. Распространенность бактерий оценивается для каждого образца с помощью классификации Sequedex данных метагеномики дробовика, и виды были идентифицированы как с помощью данных последовательности 16S (296 нуклеотидов на одно считывание), так и выбранных считываний РНК-полимеразы, идентифицированных Sequedex как филогенетически информативные.Прямые и обратные чтения анализировались отдельно и были тесно связаны. Разделение на четыре группы производилось на основе типа образца (клоакальный против фекального) и филогенетических и функциональных профилей (клоакальный: незрелый против зрелого). Полные результаты представлены в файле S1a.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225858.g001

    При анализе данных на уровне узлов (данные с рис.2) видовое богатство значительно различается между тремя группами (ANOVA: F 2,27 = 33.95, P <0,001). Опять же, все три группы значительно различались (апостериорный тест Тьюки: все значения p <0,05), и незрелые образцы клоаки имели наибольшее количество видов. Зрелая клоака имела наименьшее количество видов. Три группы значительно различались с точки зрения разнообразия Симпсона (ANOVA: F 2,27 = 55,09, P <0,001). Зрелая клоака имела меньшее микробное разнообразие, чем незрелая клоака (апостериорный тест Тьюки: P <0,001) и зрелый кал (апостериорный тест Тьюки: P <0.001) образцы. Незрелая клоака и зрелый кал существенно не отличались друг от друга (апостериорный тест Тьюки: P = 0,81).

    Рис. 2. Вариабельность филогенетического состава от образца к образцу в образцах микробиома вычисляется путем сравнения нормализованного числа считываний, набранных в определенные узлы филогенетического дерева с помощью Sequedex.

    Число считываний в каждой выборке, которые были назначены наиболее населенным узлам эталонного филогенетического дерева (S1 рис.), Показано в виде строк на этой тепловой карте.Эти строки представляют девятнадцать наиболее часто наблюдаемых видов, а цвет указывает на относительную численность: темно-синий означает ноль, а красный - более половины выборки. Эти наиболее населенные узлы составляют более 90% бактерий, присутствующих в образце, без необходимости дифференцировать доминантные виды из различных сообществ в определенных областях филогении. Названия видов были определены с использованием BLASTN с филогенетическим различением считываний полимеразных считываний rpoB и rpoC.Полные результаты представлены в файле S1b.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225858.g002

    Хотя анализ Sequedex метагеномных считываний дробовика не основан на сопоставлении, он позволяет сравнивать межвыборочное или бета-разнообразие (рис. 2). На практике высоконаселенные чтения обычно происходят в связанных группах, обсуждаемых выше и показанных на S1 Fig, поэтому можно назначить эти группы узлов конкретным видам, присутствующим в семействе, путем выборки нескольких десятков чтений филогенетических маркеров (например.РНК-полимераза) от каждого узла и проверка возвращенных совпадений с помощью BLASTN из неизбыточной базы данных NCBI. Эти названия видов представлены слева от тепловой карты на рис. 2. Полные результаты по всем филогенетическим категориям и образцам представлены в виде электронной таблицы в файле S1.

    Хотя анализ, показанный на рис. 2, не различает тонких филогенетических различий между образцами, общее сходство интенсивностей в связанных узлах указывает на сходство состава сообщества в разных образцах.Этот анализ связан с анализом OTU, основанным на выравнивании считываний 16S, что можно увидеть на тепловой карте занятости наиболее распространенных OTU (S2, рис.). Как и в случае с рис. 2, примерно 90% приписываемых считываний бактерий охватываются анализом на рис. S2, поэтому мы ожидаем обнаружения подобных организмов. Поскольку QIIME помещает OTU в таксономию, а не в дерево, таксономическое назначение часто ограничивается уровнем рода или семейства, даже с уровнем достоверности 80%. В отличие от считываний РНК-полиэраз, использованных на рис. 2, результаты, как правило, не были достаточно специфичными для определения видов.Чтобы разрешить неоднозначные случаи, мы использовали присвоение видов, которые совпадают с рисунком 2, если они встречаются, при условии присвоения уровня рода, если несколько видов совпадают одинаково хорошо, или просто выбрали хорошо известный вид для внесения в список, если другие совпадения были названы только на уровне рода.

    Другой полезный анализ OTU, обеспечиваемый данными 16S, - это кривые разрежения, показанные на рис. 3. Мы построили график количества последовательностей 16S, которые должны быть отобраны для наблюдения данного числа видов. Мы использовали R-пакет «iNEXT» [29] для разрежения и объединили отдельных птиц для трех групп.Видовое богатство между тремя группами значительно различается на основании 95% доверительных интервалов трех групп, не пересекающихся (рис. 3). Этот анализ отчетливо показывает более высокое разнообразие образцов клоаки от неполовозрелых птиц по сравнению с образцами клоаки от взрослых птиц или образцами фекалий.

    Рис. 3. Кривые разрежения 16S.

    Обогащение внутри выборки, оцененное с помощью анализа OTU последовательностей 16S с помощью QIIME [32]. Кривые разрежения рассчитываются путем отбора проб числа последовательностей 16S, указанных на оси x, и подсчета числа отдельных наблюдаемых видов, нанесенных на ось y.Заштрихованные области вокруг линий представляют 95% доверительный интервал. Ни один из доверительных интервалов не перекрывается, что позволяет предположить, что каждая группа значительно отличается от двух других, даже если рассматривать только 10 000 последовательностей.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225858.g003

    Мы дополнительно проанализировали данные, объединенные по типам (из рис. 1), чтобы сравнить состав сообщества среди трех групп (незрелая клоака, зрелая клоака и зрелый кал).Три группы значительно различались по микробному составу на основе филогенетики (PERMANOVA: R 2 = 0,49, P <0,001; рис. 4a). Каждая группа значительно отличалась от двух других групп после анализа попарных сравнений (незрелая клоака против зрелой клоаки: R 2 = 0,30, P <0,001; зрелая клоака против зрелых фекалий: R 2 = 0,56, P = 0,002; незрелая клоака по сравнению со зрелыми фекалиями: R 2 = 0,41, P <0,001), что предполагает уникальный микробиом для каждой группы.

    Рис. 4. График неметрического многомерного масштабирования (NMDS) состава трех групп.

    Эти три группы значительно различаются по своему микробному составу для обеих групп: a. филогенетическая классификация и b. функциональная классификация генов.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225858.g004

    Предвидя результаты функциональной композиции, описанные ниже, на рис. 4b представлен аналогичный анализ 962 функциональных категорий, предоставленных Sequedex.Категории функциональных генов также значительно различались между тремя группами (PERMANOVA: R 2 = 0,71, P <0,001; рис. 4b). Каждое попарное сравнение было статистически значимым (незрелая клоака против зрелой клоаки: R 2 = 0,64, P <0,001; зрелая клоака по сравнению со зрелыми фекалиями: R 2 = 0,81, P <0,001; незрелая клоака против зрелых фекалий: R 2 = 0,46, P <0,001). И филогенетические, и функциональные выходные файлы Sequedex, используемые в этих анализах, представлены в виде электронной таблицы в файле S1.

    Ни один из описанных выше анализов не дает представления о мелкомасштабных филогенетических структурах внутри сообществ. Метагеномные чтения дробовика не совпадают, в то время как чтения 16S не имеют длины и разрешения, чтобы предоставить такую ​​информацию. Однако для образцов зрелой клоаки более 80% микробной популяции, по-видимому, составляют Delftia spp ., и можно создать выравнивание гена РНК-полимеразы, особенно информативного гена филогенетического маркера.Длина ветви для каждого из четырех генов, собранных из каждого образца, различается, что указывает на наличие либо ошибок секвенирования, либо генетического разнообразия в штаммах Delftia , присутствующих в образце (S3, рис.). Результаты также показывают, что отдельные птицы можно отличить друг от друга, поскольку считывания для каждой птицы сгруппированы вместе на дереве, поэтому можно отличить птиц по тому, где их собранные считывания микробиома попадают на дерево.

    Функциональный состав микробиомов

    Как упоминалось выше, считывания метагеномики дробовика, анализируемые Sequedex, дают возможность анализировать функциональный состав метагенома способом, независимым от филогенетического анализа.Рис. 4b показывает, что оба анализа обеспечивают одинаковую способность различать образцы.

    При проведении анализа Sequedex мы решили использовать подсистемы SEED для характеристики функционального набора генов, присутствующих в образцах, отчасти потому, что они обеспечивают иерархическую классификацию функции белков. Хотя высокоуровневые категории, как правило, находятся в пределах два раза репрезентативности в геномной ДНК сообщества, некоторые различия очевидны при рассмотрении, такие как повышенный метаболизм белка в образцах фекалий и повышенная вирулентность и связанные с транспортом гены в клоаке. образцы.

    При самом высоком разрешении классификации SEED несколько примечательных подсистем обогащены различными типами образцов. Метаболизм и подсистемы клеточной стенки заметно увеличиваются в образцах фекалий, тогда как вирулентность, подвижность, мембранный транспорт и метаболизм серы увеличиваются в образцах зрелой клоаки (рис. 5b). Метаболизм азота повышен в образцах незрелой клоаки, в то время как фаги значительно повышены в образце фекалий с преобладанием Bacteroidetes (справа) по сравнению с образцами фекалий с преобладанием Firmicutes (рис. 5c).

    Рис. 5.

    A . Функциональное объединение основанной на чтении классификации ДНК или РНК в каждом образце. Классификация проводилась при каждом чтении с помощью подсистем Sequedex и SEED. В легенде справа представлен цветовой код для всех 28 функциональных категорий, а метки на графике указывают на густонаселенные категории, а также на категории, которые значительно меняются между типами образцов. Полные результаты для функциональных сводок представлены в файле S1d вспомогательной информации. В . Подсистемы, связанные с метаболизмом кала. Отобранные подсистемы, характерные для фекального микробиома, нанесены на график, а ось Y измеряет количество функционально идентифицированных считываний, связанных с конкретной подсистемой, для каждого из образцов. С . Подсистемы, связанные с метаболизмом клоаки. Отобранные подсистемы, характерные для микробиома клоаки, нанесены на график, а по оси ординат измеряется количество функционально идентифицированных считываний, связанных с конкретной подсистемой, для каждого из образцов.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225858.g005

    Взгляд с высоты птичьего полета (так сказать) на то, как все подсистемы SEED 962 представлены в тридцати образцах, показано на рис. 6. Хотя отчетливо не видно. Функциональные подсистемы «незрелой клоаки» могут быть идентифицированы, подсистемы, повышенные в образцах фекалий, в первую очередь связаны с анаэробным метаболизмом и ростом, в то время как подсистемы, повышенные в образцах зрелой клоаки, в первую очередь связаны с метаболизмом азота и выживанием в присутствии токсинов.Широко распространенные подсистемы SEED, обнаруженные в калифорнийских кондорах, включают ферментацию ацетил-КоА до бутирата, деградацию метионина, гликолиз и глюконеогенез, а также несколько различных подсистем факторов удлинения трансляции. Полная разбивка функциональных категорий по всем тридцати образцам представлена ​​в виде электронной таблицы в файле S1.

    Рис. 6. Подсистема SEED со значительными различиями между типами образцов.

    Z-баллы для разницы между образцами фекалий и незрелой клоаки на оси абсцисс отложены против показателей z для разницы между зрелыми и незрелыми образцами клоаки на оси Y для двух третей наиболее занятых функциональных категорий. .Для ясности показаны только 2/3 наиболее населенных подсистем SEED, при этом закрашенные пурпурные квадраты представляют 1/3 наиболее населенных подсистем, а чистые квадраты - среднюю группу. Используя кластеры образцов, определенные с помощью анализа PCA, определенные подсистемы идентифицируются в соответствии с их относительным представлением в образцах фекальных и незрелых клоак (ось x) и зрелых образцов клоаки по сравнению с незрелыми (ось Y) в единицах разницы, деленных на стандартное отклонение, оцененное по выборкам.Эти категории обеспечивают большее разрешение изменений, указанных в сводных данных, а полные результаты представлены в файле S1d.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225858.g006

    Обсуждение

    В этом исследовании мы взяли образцы содержащихся в неволе калифорнийских кондоров, чтобы определить индивидуальные вариации в микробиоме кишечника обитающих в неволе видов-падальщиков. Предыдущие исследования показали, что репертуар бактерий в дикой природе зависит главным образом от диеты и филогении хозяина [30, 31], а также от того, являются ли образцы птиц фекальными или клоакальными [32].На данный момент дикие кондоры недоступны для сравнения. Однако мы прогнозируем, что у диких кондоров будет более разнообразный микробиом, чем у содержащихся в неволе особей. Мы обнаружили, что неполовозрелые кондоры имеют гораздо более разнообразный микробиом, чем взрослые птицы. В этом отличие от домашней птицы и антарктических пингвинов ( Pygoscelis antarctica ), у которых разнообразие микробиома увеличивается с возрастом [23, 24]. Однако он соответствует результатам Teyssier et al. [6], которые обнаружили, что клоакальная микробиота птенцов большой синицы уменьшилась в разнообразии и увеличила относительную численность Firmicutes в возрасте от 8 до 15 дней.Хотя процесс определения различий микробного сообщества неясен, важно продолжить сравнение видов для развития микробных сообществ с возрастом людей.

    Два метода (16S и метагеномный) в значительной степени согласуются с ~ 20 видами, которые составляют примерно 89% отнесенных к геномному считыванию, обнаруженных в образцах кондоров. Однако эти два метода существенно расходятся в отношении относительной численности каждого вида в бактериальном сообществе. Одно из самых больших расхождений заключается в преобладании Delftia в зрелых образцах клоаки, которые метагеномика дробовика идентифицирует как 80% зрелых образцов клоаки, но которые почти не регистрируются в данных 16S (сравните рисунки 1 и 2 с рисунком S2). .Учитывая нашу способность собрать множественные копии гена РНК-полимеразы Delftia из этих образцов, представляется гораздо более вероятным, что метагеномная оценка дробовика является более надежной, предположительно из-за отсутствия предвзятости при амплификации, специфичной для праймеров. Это поведение согласуется с другими исследованиями, сравнивающими численность видов между целевым секвенированием 16S и подходами метагеномики дробовика [33]. Полное распределение OTU по образцам кондора представлено в файле S1c, а файл формата FASTA с репрезентативными последовательностями 16S для каждой OTU в S1c предоставляется как файл S2.

    Grond et al. [12] представляет недавний обзор исследований микробиоты кишечника птиц. В этой работе они отмечают широкое согласие между исследованиями присутствия фирмикутов, бактероидетов, протеобактерий и актинобактерий, что согласуется с нашими выводами. Ввиду значительных расхождений профилей 16S по сравнению с метагеномными дробовиками, кажется, что необходима осторожность при проведении более подробных сравнений по видам-хозяевам и условиям окружающей среды до тех пор, пока не будут проведены дополнительные исследования, характеризующие повторяемость различных методов отбора проб по образцам.Кроме того, повышенное филогенетическое разрешение, обеспечиваемое чтениями генов филогенетических маркеров на 150 пар оснований по сравнению с чтениями 16S, улучшило бы сравнение между статьями от уровня филума или рода до сравнений на уровне видов.

    Roggenbuck и др. . [14] описывают несколько ближайших соседей патогенов у стервятников: Clostridia и Fusobacteria преобладали в образцах фекалий и задней кишки стервятников. Некоторые представители этих классов бактерий патогенны для других позвоночных, а также могут быть патогенными для стервятников.Если это так, вполне вероятно, что стервятники переносят токсины патогенных бактерий, полученные из их коровьей диеты, потому что они получают выгоду от расщепления пади этими же бактериями. Мы обнаружили, что классы Clostridia и Fusobacteria доминируют в образцах фекалий калифорнийских кондоров, что также подчеркивает важность образа жизни мусорщиков в неволе. В недавнем исследовании микробиома у крупноклювых воронов или ворон джунглей ( Corvus macrorhynchos ) было обнаружено, что вороны джунглей не только приобретают патогенные микробы, но и возвращают микробы в окружающую среду через фекалии [34].Если эта картина похожа на диких калифорнийских кондоров, они могут играть важную роль в распространении патогенов в окружающей среде. Таким образом, этот вид, а также стервятники, могут использоваться в качестве видов-дозорных для понимания патогенов, присутствующих в определенных экосистемах.

    Микробный состав

    Калифорнийские кондоры, отобранные нами в этом исследовании, показали значительное разнообразие, но имеют общее ядро ​​микробов. Это могло быть связано с тем, что содержащихся в неволе птиц кормили одной и той же пищей, но, скорее всего, это связано с общей физиологией птиц.Roggenbuck et al. [14] обнаружили, что содержащиеся в неволе стервятники из зоопарка вместе делили кишечные микробы с дикими стервятниками, в то же время отличаясь от птиц, не являющихся стервятниками, которые делили свой неволей и диету. Как и стервятники, кондоры являются детритоядными животными, и все кондоры, использованные в этом исследовании, получали одинаковую сырую пищу. Наблюдаемые различия в микробиомах могут быть связаны с разными предпочтениями в отношении постного или жирного мяса или могут быть вызваны социальным статусом кондора, приводящим к различиям в рационе животных в одном и том же вольере.

    Кроме того, поскольку мы смогли взять образцы ДНК только для этого исследования, обнаруженное разнообразие может быть недостаточно репрезентативным по сравнению с фактически присутствующим. Гораздо большие различия ожидаются для образцов мРНК, в которых будут транскрибироваться только гены, используемые в конкретном отобранном окружении.

    Fusobacteria - облигатные анаэробы, ферментирующие аминокислоты, пептиды и углеводы, которые часто обнаруживаются в слоях слизи человека и животных [35]. Филогения рода Fusobacteria показана на фиг. S1, и более чем 99% нуклеотидная идентичность наблюдалась для считывания РНК-полимеразы для всех следующих видов: Fusobacterium varium , который является желудочно-кишечным видом; Ф . ulcerans , выделенный из тропических язв [35]; и F . mortiferum , анаэробный патоген человека, ферментирующий углеводы [36].

    Поверхность клоаки представляет собой слизистую оболочку, в которой могут быть обнаружены комменсальные или патогенные бактерии [37]. Он обеспечивает как первую линию защиты, так и зону, где обитают такие бактерии, как Lactobacillus spp . можно прикрепить к хосту. Delftia spp. и Comamonas spp.представляют собой микроорганизмы, которые часто составляют основную часть бактерий в биопленках, связанных с очисткой сточных вод и речных заболоченных территорий [38, 39]. Организмы в большинстве выделенных здесь образцов кондоров связаны с устойчивым образованием биопленок, устойчивостью к антибиотикам и глазными инфекциями [40–42].

    Как отмечалось ранее, многие организмы, обнаруженные у мясоедов, тесно связаны с бактериями, выделенными от людей и птиц [14]. Основная часть бактерий в фекальных микробиомах относится к классам Clostridia и Fusobacteriia, что следует из результатов исследования Videvall et al.[32], которые сравнили фекальный и клоакальный микробиомы страусов ( Stuthio camelus ). В частности, для Clostridia, преобладающего вида большинства образцов фекалий в этом исследовании, с считыванием, имеющим более 98% нуклеотидную идентичность с РНК-полимеразами в эталонных штаммах, была Clostridium perfringens . Clostridium perfringens - патоген домашней птицы, вызывающий некротический энтерит при наличии предрасполагающих факторов [43].

    Из нашего функционального анализа (см. Рис. 4) ясно, что функциональные категории различаются между образцами кала и клоаки.В то время как классы Clostridia и Fusobacteriia составляют основную часть бактерий в фекальных микробиомах, род Delftia составляет основную часть бактерий в зрелых микробиомах клоаки. Это различие, которое мы наблюдаем между фекальными и зрелыми микробиомами клоаки, также подтверждается Videvall et al. [32], который пришел к выводу, что лучше всего использовать образцы фекалий как репрезентативные для толстой кишки у птиц, а образцы фекалий и клоаки представляют только нижние части пищеварительного тракта толстой кишки.Использование нами образцов фекалий и клоаки дает дополнительную информацию о микробиоме калифорнийского кондора.

    Некоторые организмы, идентифицированные у калифорнийских кондоров, довольно близки к эталонным геномам, несмотря на то, что являются новыми видами. Примеры этих видов приведены ниже. Было обнаружено, что девяносто три процента аминокислот идентичны Propionibacterium acnes , неспорообразующему, грамположительному условно-патогенному микроорганизму, который является частью нормальной микрофлоры человека и обнаруживается в коже, полости рта, желудочно-кишечном тракте и половых органах. мочевыводящие пути [44] Bacteroides fragilis считываний были обнаружены с более чем 99% нуклеотидной идентичностью с РНК-полимеразой эталонных геномов как в образцах фекалий, так и в образцах клоаки. Bacteroides fragilis - облигатный анаэроб, который является нормальным компонентом кишечной флоры человека, но является частой причиной абсцессов и бактериемии [45–47]. Девяносто семь процентов аминокислотной идентичности считываний РНК-полимеразы наблюдали у Eggerthella YY7918, вида, который часто является частью кишечной флоры человека и был идентифицирован как причина тяжелой болезни [48]. Этот вид был обнаружен в гораздо большей численности в образцах клоаки, чем в фекальных. Shigella flexneri - неподвижный факультативный анаэробный грамотрицательный патоген, который вызывает дизентерию у людей [49, 50] и становится все более устойчивым к антибиотикам [51].

    Другие организмы, идентифицированные у калифорнийских кондоров, не очень близки к эталонным геномам. Например, Shingella flexneri был обнаружен на уровне 5–10% в образцах фекалий кондора и незрелой клоаки. Как показано на рис. 3, образцы фекалий и зрелой клоаки имеют значительно меньшее разнообразие внутри образца, чем образцы незрелой клоаки. Хотя этот метод лишен некоторых предубеждений, наличие ошибок секвенирования в данных 16S может привести к значительной переоценке количества различных последовательностей в образце.Видовое богатство ниже, чем наблюдаемое в сопоставимых исследованиях у некоторых видов птиц (см. [9]), но согласуется с тем, которое наблюдается у грифов [14].

    Функциональный состав микробов

    Функциональные профили разделяют микробные сообщества в соответствии с филогенетическими профилями и с аналогичной дисперсией среди образцов (рис. 4). Мы также продемонстрировали нашу способность идентифицировать детерминанты функциональной классификации как на крупнозернистом уровне (образцы фекалий содержат больше генов метаболизма белков и углеводов, тогда как образцы клоаки показывают больше генов транспорта и подвижности), так и на мелкозернистом уровне (фекальные образцы показывают большую репликацию и деградацию метионина, тогда как образцы клоаки показывают больший метаболизм нитратов и антитоксиновые системы).

    Геномные реестры бактерий часто сильно отличаются от их ближайших соседей или не очень-близких соседей, которые были секвенированы и депонированы в Genbank. Wu et al. 2015 [39] описывают важность метаболизма азота для биопленочного образа жизни Comomonas , и естественно задаться вопросом, обладают ли виды Delftia , которые мы рассматриваем как главный компонент зрелых образцов клоаки, способностью к восстановлению азота. Две копии альфа-, бета- и гамма-субъединиц нитратредуктазы, представленные в файле S3, указывают на то, что этот фенотип присутствует у видов Delftia , населяющих исследованных нами кондоров.

    По примеру Roggenbuck, et al. . [41], мы искали Clostridium spp . токсинов в наших образцах и представляют частичные последовательности альфа-токсина в файле S2. Хотя необходимы дополнительные исследования, чтобы понять, почему мы не видели весь ген, мы смогли восстановить значительные количества последовательностей колицина, и они записаны вместе с их последовательностями. Хотя такой подробный анализ является довольно трудоемким, он, вероятно, необходим, если функциональная характеристика микробиомов должна достичь полезного уровня детализации, как описано Grond et al.[12].

    Определение филогенетического состава естественного микробного сообщества по последовательности фрагментов ДНК является сложной задачей как из-за большой вариативности в отображении сходства последовательностей и филогенетического сходства для разных геномных фрагментов, так и из-за того, что естественные микробные сообщества часто содержат организмы, которые отличается от всего, что было культивировано, секвенировано и помещено в эталонную базу данных [28] (см. рис. S3, где показано филогенетическое дерево генов РНК-полимеразы Delftia , выделенных из образцов клоаки, по сравнению с генами из близлежащих эталонных геномов, использованных при построении базы данных Sequedex).Мы решили сравнить образцы с консервативными сигнатурными пептидами, для которых был охарактеризован уровень филогенетики, чтобы решить обе эти проблемы. Эти концепции подробно обсуждаются в статье Sequedex [28]. Sequedex использует 300000000 аминокислотных сигнатур длиной 10 для индивидуального присвоения геномных фрагментов 2550 узлам на своем филогенетическом дереве жизни для каждого вида. В каждом случае дальнейшее исследование может более точно установить филогенетический состав.

    Заключение

    Мы охарактеризовали микробиоту кишечника здоровых содержащихся в неволе калифорнийских кондоров, чтобы облегчить планирование будущих исследований и продемонстрировать новые методы, которые могут быть применены к другим системам. Полезные сигнатуры микробиома были идентифицированы путем сравнения образцов внутри и между отдельными кондорами с использованием как стандартных, так и новых методов. При отборе проб содержащихся в неволе и диких животных, необходимо сделать ряд вариантов выбора типа пробы: секвенирование ДНК или РНК, необходимая глубина секвенирования, секвенирование считываний 16S или произвольно, типы птиц (например.грамм. больные или здоровые, содержащиеся в неволе или дикие, молодые или старые) для дифференциации, если отбор проб будет производиться в рамках анализа временных рядов или в отдельные моменты времени, а также количество мест, из которых будет производиться отбор проб.

    В этой работе мы смогли идентифицировать различные виды микробов в образцах клоаки и фекалий, а также интерпретировать различия в функциональном дополнении генов в двух группах образцов. Один из наиболее интересных результатов этого исследования - разнообразие неполовозрелых птиц на 40% выше, чем у взрослых кондоров.

    Пакет программного обеспечения Sequedex позволяет быстро анализировать такие наборы данных за несколько часов на портативном компьютере. Он предоставляет как легко интерпретируемые выходные файлы, профилирующие как филогенез, так и функции без сложных нелинейных процессов, таких как сборка, а также аннотацию необработанных считываний, чтобы обеспечить последующий подтверждающий анализ. В сочетании с надлежащим отбором образцов, например, у дозорных видов в верхней части пищевой сети, возможность сбора богатых информацией данных по всему миру будет удовлетворять острую потребность в мониторинге воздействия изменения климата на экосистемы, чтобы направлять усилия по смягчению последствий.Кроме того, в случае успеха эта работа открывает возможность использования профилей микробиома и наблюдения за болезнями других дозорных видов для получения срочно необходимых конкретных признаков здоровья экосистемы [52].

    Материалы и методы

    Заявление об этике

    Методы, использованные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Лос-Аламосской национальной лаборатории (LANL) и не повлияли на здоровье и благополучие животных. Все государственные и федеральные разрешения на разведение дикой природы и в неволе принадлежат Фонду Сапсана (Бойсе, Айдахо).Все лабораторные процедуры для биологических образцов были одобрены Комитетом по биобезопасности LANL.

    Сбор образцов

    Наши образцы для исследования взяты от 22 содержащихся в неволе взрослых и неполовозрелых (год вылупления) птиц из питомника Peregrine Fund в Бойсе, штат Айдахо. С 1996 года Фонд Сапсана занимается разведением и выращиванием калифорнийских кондоров в неволе для выпуска в природу. Отобранные кондоры жили в неволе с момента вылупления, получали контролируемую диету, состоящую в основном из грызунов, кроликов и промысловых хищных птиц, и были размещены в одном здании.Все птицы были размещены вместе и ежедневно придерживаются одного и того же рациона. В то время как птицы могут содержаться отдельно между клетками, из-за открытой конструкции помещения и передвижения птиц, их можно рассматривать как выращенных вместе без изоляции друг от друга в отношении воздействия микробов и соблюдения одной и той же диеты.

    С октября 2013 г. по начало января 2014 г. было собрано

    образцов фекалий как у взрослых, так и у неполовозрелых кондоров в течение 30 минут после дефекации.Образцы клоаки были собраны во время плановых проверок здоровья персоналом учреждения и ветеринарами. Образцы фекалий (n = 10) и клоаки (n = 20) были помещены в стерильные пластиковые пробирки для образцов при отборе и хранении в морозильной камере -20 ° C в течение 10–30 минут после сбора. Образцы клоаки сохраняли на сухих флокированных тампонах (HydraFlock, Puritan Guilford, ME) в стерильных пластиковых пробирках для сбора образцов без реагента. Стратегия отбора проб была разработана в первую очередь с учетом затрат на определение последовательности и количества имеющихся птиц.Десять образцов фекалий кондоров (9 неполовозрелых птиц и 1 взрослая особь) и 20 образцов клоаки (15 неполовозрелых птиц и 5 взрослых особей) были взяты для анализа от разных особей, всего было секвенировано 30 образцов.

    Выделение ДНК

    Непосредственно перед анализом замороженные образцы фекалий разбавляли водой и встряхивали. Клоакальные мазки ресуспендировали в воде встряхиванием. К образцам добавляли буфер для лизиса из набора для выделения ДНК грибков / бактерий (Zymo Research, Ирвин, Калифорния), и лизис выполняли в течение 40 секунд в пробирках с шариками ZR (Zymo Research, Ирвин, Калифорния) с использованием прибора Fastprep 24. (MPBio).ДНК клоаки очищали с использованием того же набора (Quick DNA Fungal / Bacterial Miniprep Kit, Zymo Cat. # D6005) в соответствии с протоколом производителя. ДНК определяли количественно с использованием инструментов Qubit и варьировали от уровня ниже уровня обнаружения до 60 нг / мкл. Целостность ДНК оценивали с использованием 1% агарозных гелей с маркером лямбда-ДНК / HindIII (Thermo Fisher Scientific, № по каталогу SM0102).

    Подготовка библиотеки и секвенирование

    Для образцов метагеномики дробовика библиотеки Illumina были подготовлены с использованием набора для подготовки библиотеки ДНК NEBNext Ultra (New England Biolabs, Cat.# E7370S) согласно протоколу производителя. Из-за различного количества экстрагированной ДНК вводимое количество ДНК варьировалось от 100 нг до менее 1 нг. ДНК фрагментировали с использованием Covaris E220, концы затупляли, а к концам фрагментов добавляли адаптеры и индексы до обогащения с помощью ПЦР. Для образцов с вводом менее 10 нг ДНК количество циклов ПЦР было увеличено с 12 до 15. Метагеномные библиотеки Illumina были очищены с использованием гранул AMPure XP (Beckman Coulter, Cat.# A63881) перед элюированием в буфере для элюции ДНК (Zymo Research, Cat. # D3004-4-10). Концентрацию библиотек получали с использованием анализа Qubit dsDNA HS (ThermoFisher Scientific, № по каталогу Q32854). Средний размер библиотеки определяли с помощью набора Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent, Cat. № 5067–4626). Точная количественная оценка библиотеки была определена с использованием набора для количественного анализа библиотек - Illumina / Universal Kit (KAPA Biosystems, № по каталогу KK4824). Библиотеки секвенировали на Illumina NextSeq, генерируя считывания с парным концом 151 п.о.

    Для секвенирования 16S использовали вырожденные праймеры, которые амплифицируют область V4 бактериальных генов рДНК (515–806 пар). Из-за различного количества экстрагированной ДНК ввод ДНК варьировался от 12,5 до менее 1 нг. В первом раунде ПЦР амплифицировали область V4 и добавили уникальные метки к ампликону, используя температуру денатурации 95 ° C в течение 3 минут, 25 циклов при 95 ° C в течение 30 секунд, 55 ° C в течение 30 секунд и 72 ° C для 30 секунд с последующим увеличением до 72 ° C в течение 5 минут перед выдержкой при 4 ° C.Во втором раунде ПЦР добавлялись специфические последовательности адаптеров для секвенирования Illumina и использовалась температура денатурации 95 ° C в течение 3 минут, 8 циклов 95 ° C в течение 30 секунд, 55 ° C в течение 30 секунд и 72 ° C в течение 30 секунд, а затем при увеличении до 72 ° C в течение 5 минут перед выдержкой при 4 ° C. Ампликоны очищали с использованием гранул AMPure XP (Beckman Coulter, № по каталогу A63881). Контроль без матрицы был обработан, но не показал полосы в области ампликона V4 и не был дополнительно обработан. Уникальные теги позволяли объединять несколько ампликонов.Концентрацию пула ампликонов получали с использованием анализа Qubit dsDNA HS (ThermoFisher Scientific, № по каталогу Q32854). Средний размер библиотеки определяли с помощью набора Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent, Cat. № 5067–4626). Точная количественная оценка библиотеки была определена с использованием набора для количественного анализа библиотек - Illumina / Universal Kit (KAPA Biosystems, № по каталогу KK4824). Пул ампликонов секвенировали на Illumina MiSeq, генерируя считывание парных концов длиной 301 п.н.

    Геномный анализ

    метагеномов дробовика были проанализированы на филогенетическое и функциональное содержание в соответствии с деревом жизни из 2550 видов, а 963 функциональных категории SEED использовались с пакетом Sequedex [28] (http: // sequedex.lanl.gov/). Sequedex - это анализ на основе сигнатурных пептидов, который приписывает как филогению, так и функцию независимо каждому считыванию на основе своей базы данных из 300 миллионов сигнатурных пептидов. Он позволяет избежать многих распространенных ошибок методов анализа на основе сборки, взрыва или генов и подробно описан в Berendzen et al. 2012.

    Хотя существуют методы, позволяющие попытаться идентифицировать отдельные таксоны компонентов в сложной выборке [53], в нашем случае мы решили просто набирать считывания из этих образцов в аминокислотные эталонные последовательности для генов РНК-полимеразы, используя рамку считывания для каждого идентифицированного считывания. пользователя Sequedex.В этом случае мы можем собрать ген филогенетического маркера, достаточно длинный для подробного филогенетического анализа, и дать некоторое представление о том, есть ли у разных птиц разные виды. Прямая оценка функционального профиля микробиома была получена из основанного на чтении функционального назначения иерархической схеме классификации подсистем SEED, также с использованием Sequedex [28]. Как и в случае с филогенией, объединение чтений в общепринятые функциональные категории может вводить в заблуждение. Аннотации для чтения, предоставленные Sequedex, позволили нам анализировать не только полное представление конкретной подсистемы SEED, но также значительно облегчили нашу способность извлекать определенные гены из метагеномных образцов дробовика.Мы продемонстрировали эту способность на пяти репрезентативных генах: филогенетическом маркере rpoB, гене метаболической ниши, нитратредуктазе, бета-лактамазе и токсине Clostridium . Файл S3 предоставляет последовательности примеров генов.

    В методах филогенетической подписи важные паттерны, общие для всех таксонов, идентифицируются с позициями на предварительно рассчитанном дереве с помощью алгоритма наименьшего общего предка. В принципе, не имеет значения, являются ли эти сигнатуры генетическими или анатомическими.Однако для генетических сигнатур некоторые паттерны появляются у нескольких видов по причинам, отличным от филогении (например, триплетные повторы ДНК, которые могут быть артефактами механизмов репликации, или горизонтально перенесенные гены появляются из-за общих экологических ниш). В нашем анализе те подписи-кандидаты, которые являются частью повторяющейся области последовательности, были отброшены, а классифицирующая способность оставшегося набора подписей была охарактеризована. Хорошие наборы сигнатур обладают как высокой избирательностью, так и высокой чувствительностью.Мы охарактеризовали набор сигнатур, который мы использовали, как имеющий аналогичную чувствительность к BLASTX, но имеющий более чем на порядок более высокую селективность при использовании для филогенетической классификации коротких чтений, таких как те, которые использовались в этом эксперименте [28].

    Функциональные профили Sequedex предоставили поддержку и дополнительную информацию о детерминантах ниши, полученных на основе микробиологии конкретных видов организмов, обнаруженных в каждом образце. На образцах были выполнены как филогенетическое отнесение, так и анализ инвентаризации генома, что позволило разделить идентифицированные бактерии на три вероятные группы: микробы, важные для пищеварения, микробы, связанные со средой слизистой оболочки, и потенциальные патогены, представляющие интерес.

    В этой работе мы решили идентифицировать специфические чтения филогенетического маркерного гена, РНК-полимеразы, для дальнейшего изучения с использованием BLASTN против неизбыточной базы данных в NCBI. Считывания последовательности, соответствующие гену филогенетического маркера, РНК-полимеразе, были идентифицированы из каждого из этих узлов и присвоена таксономия с использованием NCBI для взрыва нуклеотидного фрагмента (blastn) против базы данных нуклеотидов (nt). После изучения примерно дюжины чтений таким способом можно определить виды для каждого набора узлов.

    Изучив подсистемы SEED, идентифицированные в файле S1e, а также количество чтений, назначенных конкретным семействам Pfam в файле S1f, мы смогли найти образцы и гены, которые, вероятно, имеют достаточно высокую распространенность, чтобы их можно было собрать и сравнить с литературой. Мы предоставляем два примера бета-лактамаз в файле S2, где эталонный ген использовался в качестве матрицы, и транслированные пептидные последовательности были сопоставлены с ним путем определения точных 10-мерных совпадений с эталоном. Для каждой ссылки было набрано два примера, чтобы дать некоторое представление о вариабельности результирующей последовательности, которая набирается этим методом.

    Метод анализа, который мы здесь используем, Sequedex, является примером метода анализа на основе сигнатур [28]. Сигнатурные методы имеют выдающуюся историю в целом ряде научных дисциплин как способ выявления ценных генов в ситуациях, когда применение фундаментальной теории может быть сложным. Скрытые марковские модели аминокислотных последовательностей являются примером сигнатурных методов, в отличие от BLAST, который обычно используется в качестве метода профилирования.

    Статистический анализ

    Мы сравнили показатели структуры сообществ между тремя группами (возраст и тип выборки), включая видовое богатство, видовое разнообразие и состав сообщества.Для определения разнообразия видов мы использовали индекс разнообразия Симпсона. Мы проверили различия в богатстве и разнообразии между этими группами, используя однофакторный дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом Тьюки для проверки попарных различий между группами. Допущения нормальности и равных дисперсий для параметрических тестов были выполнены.

    Состав сообщества среди трех групп (возраст и тип выборки) сравнивался с использованием неметрического многомерного шкалирования (NMDS) с использованием функции metaMDS в веганском пакете (версия 2.4–4; [54]) в R (версия 3.4.1; [55]). Было проведено два отдельных посвящения NMDS; один основан на филогенетике, а другой - на функциональных категориях генов. Для проверки общих различий между группами были рассчитаны расстояния Брея-Кертиса, а затем исследованы с помощью перестановочного многомерного дисперсионного анализа (PERMANOVA). Функция адониса (веганская) использовалась с 1000 перестановками. Чтобы проверить различия между каждой группой, были запущены попарные PERMANOVA, каждая с 1000 перестановками, и полученные p-значения сравнивались с альфа-коэффициентом, скорректированным по Бонферрони, равным 0.017. Лучшее понимание разнообразия организмов, присутствующих в образцах, может быть получено с помощью филогенетического анализа. Мы сравнили отдельные копии генов РНК-полимеразы, собранные в результате прямого или обратного чтения в каждом образце. Собранные гены наиболее близки к двум эталонным геномам Delftia , причем один из двух - Delftia acidovorans , а другой ссылке не присвоено название вида. Наблюдаемое филогенетическое разделение генов микробиома кондора, по-видимому, соответствует эталонной Delftia на уровне рода, но не на уровне вида.Четыре гена, собранные из каждого образца кластера вместе на дереве, указывают на то, что организмы каждой птицы генетически отличаются друг от друга.

    Анализ данных 16S был проведен с помощью QIIME версии 1.8 [56] с репрезентативными последовательностями 16S, предоставленными в файле S2, и были выбраны с помощью утилиты QIIME, single_rarefaction.py и значения для параметра сходства последовательностей 0,94. Аннотации последовательностей 16S были сделаны путем сравнения с базой данных 97_otus.fasta.

    Дополнительная информация

    S1 Рис.Филогенетические деревья четырех родов бактерий кондоров.

    Крупные планы эталонного дерева чтений, набранных для четырех репрезентативных образцов, с выделением области филогенетического дерева рядом (вверху слева) Fusobacterium mortiferum , (вверху справа) Clostridium perfringens , (внизу слева) Lactobacillus johnsonii и (внизу справа) Propionibacterium avidum . Отобранные считывания из филогенетического маркерного гена (РНК-полимераза) исследовали с помощью Blastn или Blastp в сопоставлении с неизбыточными базами данных в NCBI, чтобы идентифицировать наиболее близкий эталонный организм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225858.s001

    (PNG)

    S2 Рис. Результаты анализа 16S OTU.

    Доля образца, представленная в указанном OTU, показана в виде тепловой карты с коэффициентом двойного отношения между соседними цветами, которые переходят от темно-синего к красному. Строки отсортированы филогенетически, в то время как столбцы расположены в том же порядке, что и в таблице 1 и на рис. 1, но с двумя образцами, для которых образцы 16S не удались, не включены в тепловую карту. Столбцы представляют разные образцы в том же порядке, что и на рис. 2, а строки представляют разные узлы филогении.Слева от тепловой карты мы приводим наиболее конкретное филогенетическое присвоение QIIME с уровнем достоверности 80%, филогенетически сгруппированное в том же порядке, что и на рис. 2. Эти филогенетические отнесения соответствуют последовательностям 16S, депонированным в архиве чтения последовательностей для эта учеба. Репрезентативные последовательности 16S представлены в файле S2 и пронумерованы в соответствии с идентификаторами, указанными слева на тепловой карте выше. Справа от тепловой карты приведены названия видов, выведенные из последовательности 16S, и сведения о том, какие виды были обнаружены с помощью считываний нуклеотидов РНК-полимеразы, идентифицированных Sequedex из данных секвенирования дробовика. каждую OTU сравнивали с проектом базы данных рибосом с использованием BLASTN для идентификации видов, представленных справа от рисунка.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225858.s002

    (PNG)

    S3 Рис. Филогения микробиомов кондоров, сравнивающая гены, собранные из каждого образца, с соседними генами из эталонного дерева Sequedex.

    Филогенетическое дерево генов РНК-полимеразы из эталонных геномов, филогенетически близких к Delftia, и четыре собранных гена РНК-полимеразы из каждого из пяти образцов зрелой клоаки. Номера образцов «CCP.xx» относятся к таблице 1, а «1» или «2» относятся к прямому и обратному чтению, которые хранились отдельно.Две эквивалентные сборки были сделаны как для прямого, так и для обратного чтения, и они обозначаются как «a» и «b». Выравнивание, используемое для вычисления дерева, предоставляется в виде дополнительного текстового файла. S3 Фиг. Показывает филогенетическое дерево, полученное в результате такого анализа.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225858.s003

    (PNG)

    S4 Рис. Подсистемы, связанные со стрессовой реакцией.

    Отобранные подсистемы, отличающиеся реакцией на стресс и отток токсичных соединений, нанесены на график, с осью Y, измеряющей количество функционально идентифицированных считываний, связанных с конкретной подсистемой, для каждого из образцов.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225858.s004

    (TIF)

    S5 Рис. Подсистемы, связанные с метаболизмом кала.

    Отобранные подсистемы, отличительные от фекального микробиома, нанесены на график, а по оси ординат измеряется количество функционально идентифицированных считываний, связанных с конкретной подсистемой, для каждого из образцов.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225858.s005

    (TIF)

    S1 Файл. Таблица с шестью вкладками (a-f) филогенетической и функциональной классификаций по различным показателям.

    (a) Филогенетическая свертка с использованием Sequedex для классификации метагеномных считываний дробовика. (b) Нормализованное количество чтений, назначенных каждому узлу филогенетического дерева Sequedex. (c) Операционная таксономическая единица (OTU) подсчитывает для чтения 16S из каждого образца. (d) Функциональное объединение с использованием Sequedes для классификации метагеномных считываний дробовика в соответствии с высокоуровневыми классификациями SEED. (e) Нормализованное количество метагеномных считываний дробовика, присвоенное каждой подсистеме SEED. (f) Нормализованное количество метагеномных считываний дробовика, присвоенное каждому семейству Pfam.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225858.s006

    (XLSX)

    Благодарности

    Мы хотели бы поблагодарить T. Cade и R. Watson из Фонда Peregrine за их помощь в инициировании этого исследования и Peregrine Fund за сбор образцов фекалий и мазков калифорнийского кондора.

    Ссылки

    1. 1. Kelly TR, Rideout BA, Grantham J, Brandt J, Burnett LJ, Sorenson KJ и др.Два десятилетия совокупного воздействия на выживание находящихся под угрозой исчезновения калифорнийских кондоров в Калифорнии. Biol Cons. 2015; 191: 391–9.
    2. 2. Д’Элия Дж., Хейг С.М., Маллинз Т.Д., Миллер М.П. Древняя ДНК показывает значительное генетическое разнообразие калифорнийского кондора ( Gymnogyps californianus ) до возникновения узкого места в популяции. Кондор. 2016; 118: 703–14.
    3. 3. Straub MH, Kelly TR, Rideout BA, Eng C, Wynne J, Braun J и др. Сероэпидемиологическое исследование потенциальных патогенов у облигатных и факультативных видов птиц в Калифорнии.PLoS ONE. 2015; 10: e0143018 – e. pmid: 26606755
    4. 4. Уэйт Д.В., Тейлор М. Изучение микробиоты кишечника птиц: текущие тенденции и будущие направления. Front Microbiol. 2015; 6. pmid: 261
    5. 5. Уэйт Д.У., Тейлор М.В. Характеристика микробиоты кишечника птиц: членство, влияние на движение и потенциальная функция. Front Microbiol. 2014; 5: 223-. pmid: 248
    6. 6. Teyssier A, Lens L, Matthysen E, White J Динамика разнообразия кишечной микробиоты на раннем этапе развития птичьего хозяина: данные эксперимента с перекрестным приемным устройством.Front Microbiol. 2018; 9. pmid: 30038608
    7. 7. Динсдейл Э.А., Эдвардс Р.А., Холл Д., Энгли Ф., Брейтбарт М., Брюлк Дж. М. и др. Функциональное метагеномное профилирование девяти биомов. Природа. 2008; 452: 629–32. http://www.nature.com/nature/journal/v452/n7187/suppinfo/nature06810_S1.html pmid: 18337718
    8. 8. Кинан С.В., Энгель А.С., Эльси Р.М. Микробиом кишечника аллигатора и последствия для симбиоза архозавров. Научные отчеты. 2013; 3: 2877. pmid: 24096888
    9. 9. Вэй С., Моррисон М., Ю З. Бактериальная перепись микробиома кишечника домашней птицы.Poultry Sci. 2013; 92: 671–83. pmid: 23436518
    10. 10. Уэйт Д.В., Дайнес П., Тейлор М.В. Микробиом кишечника находящегося под угрозой исчезновения новозеландского попугая Какапо ( Strigops habroptilus ). PLoS ONE. 2012; 7: e35803 – e. pmid: 22530070
    11. 11. Bahrndorff S, Alemu T., Alemneh T., Lund Nielsen J. Микробиом животных: значение для природоохранной биологии. Internat J Genomics. 2016; 2016. pmid: 27195280
    12. 12. Гронд К., Сандеркок Б.К., Джамппонен А., Зеглин Л.Х. Микробиота кишечника птиц: сообщество, физиология и функции у диких птиц.J Avian Biol. 2018; 49: e01788.
    13. 13. Борбон-Гарсия А., Рейес А., Вивес-Флорес М., Кабальеро С. Неволи формируют микробиоту кишечника андских медведей: данные о наблюдении за здоровьем. Front Microbiol. 2017; 8: 1316. pmid: 28751883
    14. 14. Roggenbuck M, Bærholm Schnell I, Blom N, Bælum J, Bertelsen MF, Sicheritz-Pontén T. и др. Микробиом стервятников Нового Света. Nature Comm. 2014; 5: 5498 http://www.nature.com/articles/ncomms6498#supplementary-information.pmid: 25423494
    15. 15. Marin C, Palomeque M, Marco-Jimenez F, Vega S Дикие грифы-грифы (Gyps fulvus) как источник Salmonella и Cempylobacter на востоке Испании. PLoS ONE. 2004; 9: e9191. pmid: 24710464
    16. 16. Сульзнер К., Келли Т., Смит В., Джонсон С.К. Кишечные патогены и устойчивость к противомикробным препаратам у грифов-индюков (Cathartes aura), питающихся на стыке дикой природы и домашнего скота. J Zoo Wildl Med. 2014; 45: 931–4. pmid: 25632686
    17. 17. Хьюстон, округ Колумбия, Купер Дж. Э. Пищеварительный тракт белоспинного грифона и его роль в передаче болезней среди диких копытных.J Wildl Dis. 1975; 11: 306–13. pmid: 239254
    18. 18. Beasley DE, Koltz AM, Lambert JE, Fierer N, Dunn RR Эволюция кислотности желудка и ее значение для микробиома человека. PLoS ONE. 2015; 10: e0134116 – e. pmid: 26222383
    19. 19. Меткалф Дж. Л., Сонг С. Дж., Мортон Дж. Т., Вайс С., Сегин-Орландо А., Джоли Ф. и др. Оценка воздействия одомашнивания и содержания в неволе на микробиом кишечника лошади. Научные отчеты. 2017; 7: 15497. pmid: 285
    20. 20. Clayton JB, Vangay P, Huang H, Ward T., Hillmann BM, Al-Ghalith GA, et al.Пленение очеловечивает микробиом приматов. Proc Nat Acad Sci. 2016; 113: 10376. pmid: 27573830
    21. 21. McKenzie VJ, Song SJ, Delsuc F, Perst TL, Oliverio AM, Korpita TM и др. Влияние неволи на микробиом кишечника млекопитающих. Интеграт Comp Biol. 2017; 57: 690–704. pmid: 28985326
    22. 22. Hird SM Эволюционной биологии нужны дикие микробиомы. Front Microbiol. 2017; 8. pmid: 28487687
    23. 23. Баллоу А.Л., Али Р.А., Мендоза М.А., Эллис Дж. К., Хассан Х. М., Крум В. Дж. И др.Развитие микробиома цыплят: как раннее воздействие влияет на будущее микробное разнообразие. Front Vet Sci. 2016; 3. pmid: 26835461
    24. 24. Барбоса А., Балаге В., Валера Ф., Мартинес А., Бензал Дж., Мотас М. и др. Возрастные различия в микробиоте желудочно-кишечного тракта антарктических пингвинов (Pygoscelis antarctica). PLoS ONE. 2016; 11: e0153215 – e. pmid: 27055030
    25. 25. Ван Доген ВФД, Уайт Дж., Брандл Х.Б., Мудли Ю., Мерклинг Т., Леклер С. Возрастные различия в микробиоте клоаки у диких видов птиц.BMC Ecology. 2013; 13. pmid: 23531085
    26. 26. Годой-Виторино Ф., Гольдфарб К.С., Броди Э.Л., Гарсиа-Амадо М.А., Микеланджели Ф., Домингес М.Г. Б. Микробная экология развития культуры листоядного хоацина. ISME J. 2010; 4: 611–20. pmid: 20130656
    27. 27. Джовел Дж., Паттерсон Дж., Ван В., Хотте Н., О’Киф С., Митчел Т. и др. Характеристика микробиома кишечника с использованием 16S или метагеномики дробовика. Front Microbiol. 2016; 7: 459. pmid: 27148170
    28. 28.Берендзен Дж., Бруно Уильям Дж., Кон Джудит Д., Хенгартнер Николас В., Куске Шерил Р., МакМахон Бенджамин Х и др. Быстрая филогенетическая и функциональная классификация коротких геномных фрагментов с сигнатурными пептидами. BMC Res Notes. 2012; 5: 460-. pmid: 22925230
    29. 29. Чао А., Готелли, штат Нью-Джерси, Се Т.К., Сандер Э.Л., Ма К.Х., Колвелл Р.К. и др. Редкость и экстраполяция с числами Хилла: основа для выборки и оценки в исследованиях видового разнообразия. Ecol Monog. 2014; 84: 45–67.
    30. 30. Hird SM, Sánchez C, Carstens BC, Brumfield RT Сравнительная микробиота кишечника 59 неотропических видов птиц. Front Microbiol. 2015; 6. pmid: 26733954
    31. 31. Витал М., Гао Дж., Риццо М., Харрисон Т., Тидже Дж. М. Диета является основным фактором, регулирующим структуру сообщества, производящего фекальный бутират, у млекопитающих, авес и рептилий. ISME J. 2014. pmid: 25343515
    32. 32. Videvall E, Strandh M, Engelbrecht A, Cloete S, Cornwallis CK Измерение кишечного микробиома у птиц: Сравнение образцов фекалий и клоаки.Ресурсы Molecul Ecol. 2018; 18: 424–34. pmid: 29205893
    33. 33. Раззаути М., Галан М., Бернард М., Маман С., Клопп С., Шарбоннель Н. и др. Сравнение секвенирования транскриптома и метагеномики 16S для обнаружения бактериальных патогенов в дикой природе. Plos Neglected Trop Dis. 2015; 9. pmid: 26284930
    34. 34. Маэда I, Сиддики МСР, Нодзава-Такеда Т., Цукахара Н., Тани Ю., Наито Т. и др. Численность популяции потенциально патогенных организмов в микробиоме кишечника Jungle Crow ( Corvus macrorhynchos ) показана с помощью анализа микробного сообщества на основе гена 16S рРНК.BioMed Res Internat. 2013; 2013: 5-. pmid: 24058905
    35. 35. Citron DM Последние сведения о таксономии и клинических аспектах рода Fusobacterium. Clin Infect Dis. 2002; 35: S22 – S7. pmid: 12173104
    36. 36. Томпсон Дж., Робриш С.А., Баума С.Л., Фридберг Д.И., Фолк Дж. Фосфо-β-глюкозидаза из Fusobacterium mortiferum: очистка, клонирование и инактивация с помощью 6-фосфоглюконо-δ-лактона. J. Bacteriol. 1997; 179: 1636–45. pmid: 24
    37. 37. Энгевик М., Ганеш Б., Морра С., Лук Б., Версалович Дж. Модуляция и прилипание кишечной слизи комменсальными бактериями и патогеном C . difficile . Faseb J. 2015; 29.
    38. 38. Баррионуево М., Вулло Д. Бактериальное плавание, роение и хемотаксическая реакция на присутствие тяжелых металлов: что может повлиять на эффективность биоочистки сточных вод? Мир J Microbiol Biotech. 2012; 28: 2813–25. pmid: 22806721
    39. 39. Wu Y, Shukal S, Mukherjee M, Cao B Участие в денитрификации полезно для биопленочного образа жизни Comamonas testosteroni: механистическое исследование и его влияние на окружающую среду.Environ Sci Technol. 2015; 49: 11551–9. pmid: 26327221
    40. 40. Кам С.-К, Ли В-С, Оу Т-И, Тенг С.-О, Чен Ф-Л Delftia acidovorans Бактериемия, связанная с восходящими инфекциями мочевыводящих путей, подтвержденная молекулярным методом. J Exper Clin Med. 2012; 4: 180–2.
    41. 41. Wiley L, Odom JV, Bridge DR, Wiley LA, Elliott T, Olson JC. Разнообразие бактериальных биопленок при заболеваниях, связанных с контактными линзами: новая роль Achromobacter, Stenotrophomonas и Delftia. Invest Ophthalmol Visual Sci.2012; 53: 3896–905. pmid: 22589441
    42. 42. Азеведо А.С., Алмейда С., Мело Л.Ф., Азеведо Н.Ф. Взаимодействие между атипичными микроорганизмами и E . coli в биопленках мочевыводящих путей, связанных с катетером. Биообрастание. 2014; 30: 893–902. pmid: 25184430
    43. 43. Стэнли Д., Ву С.-Б, Роджерс Н., Свик Р., Мур Р. Дифференциальные ответы микробиоты слепой кишки на рыбную муку, Eimeria и Clostridium perfringens в модели заражения некротическим энтеритом у кур.PLoS ONE. 2014; 9: e104739 – e. pmid: 25167074
    44. 44. Макдауэлл А., Барнард Э., Надь И., Гао А., Томида С., Ли Х и др. Расширенная схема мультилокусного типирования последовательностей для Propionibacterium acnes : Исследование «патогенных», «комменсальных» и устойчивых к антибиотикам штаммов (расширенный MLST для Propionibacterium acnes ). Поз ОДИН. 2012; 7: e41480 – e. pmid: 22859988
    45. 45. Cerdeño-Tárraga AM, Crossman LC, Lennard N, Harris B., Quail MA, Barron A, et al.Обширные инверсии ДНК в B . fragilis геном контролирует экспрессию вариабельного гена. Наука. 2005; 307: 1463–5. pmid: 15746427
    46. 46. Ndamukong IC, Gee J, Smith JC. Экстрацитоплазматический сигма-фактор EcfO защищает Bacteroides fragilis от окислительного стресса. J Bacteriol. 2013; 195: 145–55. pmid: 23104808
    47. 47. Galvão BPGV, Rafudeen MS, Abratt VR, Weber BW, Ferreira EO, Patrick S Идентификация адгезина коллагена I типа Bacteroides fragilis .PLoS ONE. 2014; 9. pmid: 24618940
    48. 48. Saunders EH Полная последовательность генома штамма типа Eggerthella lenta (IPP VPI 0255T). Stand Genomic Sci. 2009; 1. pmid: 21304654
    49. 49. Zychlinsky A, Prevost MC, Sansonetti PJ Shigella flexneri индуцирует апоптоз в инфицированных макрофагах. Природа. 1992; 358: 167–9. pmid: 1614548
    50. 50. Санада Т., Ким М., Мимуро Х., Сузуки М., Огава М., Ояма А. и др. Эффектор OspI Shigella flexneri деамидирует UBC13, чтобы ослабить воспалительную реакцию.Природа. 2012; 483: 623–6. pmid: 22407319
    51. 51. Cai X, Zhang J, Chen M, Wu Y, Wang X, Chen J и др. Влияние потенциальных ингибиторов гистидинкиназы PhoQ на вирулентность Shigella flexneri. PLoS ONE. 2011; 6: e23100 – e. pmid: 21853073
    52. 52. Раппорт Д. Д., Хильден М. Растущая роль экологических показателей: от документирования экологических условий до мониторинга движущих сил и ответных мер политики. Индикаторы Ecol. 2013; 28: 10–5.
    53. 53. Zhu SJ, Almagro-Garcia J, McVean G Деконволюция множественных инфекций в Plasmodium falciparum на основе данных высокопроизводительного секвенирования.Биоинформатика. 2017; 34: 9–15. pmid: 28961721
    54. 54. Оксанен Дж., Бланше Ф.Г., Френдли М., Киндт Р., Лежандр П., МакГлинн Д. и др. веганский: Пакет «Экология сообщества». Пакет R версии 2.4–4. https://CRAN.R-project.org/package=vegan. 2017.
    55. 55. Команда RC. Язык и среда для статистических вычислений. Фонд R для статистических вычислений, Фонд R для статистических вычислений https://www.R-project.org. Вена, Австрия 2017.
    56. 56. Капорасо Дж. Г., Джастин К., Джесси С., Кайл Б., Фредерик Д. Б., Элизабет К. К. и др.QIIME позволяет анализировать данные секвенирования сообщества с высокой пропускной способностью. Методы природы. 2010; 7: 335-. pmid: 20383131
    .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *