Индикаторы напряжения до 1000в: Указатели напряжения до 1000 В купить, цена и наличие на сайте Электрик-Мастер

Содержание

Указатели напряжения: виды, назначение, правила пользования

Одним из самых важных приборов для электромонтажника и прочих электриков является указатель напряжения. От него напрямую зависит безопасность электромонтера или оперативного персонала, ведь по показаниям данного устройства можно определить есть электрический ток в проводнике или нет. В этой статье мы рассмотрим виды указателей напряжения, назначение и правила пользования ими.

Разновидности устройств

Указатели до 1000 вольт и выше 1000 вольт имеют разные внешние и конструктивные особенности. Для низковольтных измерений, до 1 кВ, существуют два вида устройств:

  • однополюсный, реагирующий на протекание емкостного тока;
  • двухполюсный, подает индикацию при протекании через него активного тока.

Однополюсный указатель предназначен для работы в цепях переменного тока, для обнаружения фазного проводника, в цепях освещения, при фазировке электросчетчика, проверке патронов в светильниках. Проще говоря для обнаружения провода под напряжением.

Однополюсные устройства индикации фазы имеют одинаковую конструкцию и, как правило, состоят из газоразрядной лампы индикатора, с порогом зажигания от 90 до 120 вольт и резистора на 1 МОм резистора, подключенного последовательно. Резистор ограничивает ток до безопасной величины, порядка 0.5 мА.

Индикатор ИН — 90 изготовлен в виде отвертки.

К недостаткам таких индикаторов можно отнести низкую чувствительность (порог индикации некоторых приборов начинается от 90 вольт), а также чувствительность к наводкам в соседних проводах.

Для сетей выше 1000 вольт указатели напряжения изготавливаются с рукоятками из изоляционного материала и длинной, исключающую приближение человека к токонесущим элементам. Внешний вид УВН-10 предоставлен на фото ниже:

При измерении напряжений выше 1000 вольт прибегают к использованию дополнительных защитных средств: резиновые рукавицы, боты или изоляционный коврик. Узнать, какие электрозащитные средства используют в установках выше 1000 вольт, вы можете из нашей статьи!

Двухполюсный указатель состоит из двух корпусов из изоляционного материала и гибкого медного проводника в изоляции, который их соединяет. Схема двухполюсного индикатора напряжения типа УНН-10:

В данной схеме газоразрядный индикатор шунтирован резистором, что делает схему нечувствительной к наведенным напряжениям. Также на его основе выпускается индикатор с указателем величины напряжения УН-1:

В данном приборе используется специальная линейная газоразрядная лампа и шкала на корпусе с градуировкой 127, 220, 380, 500 Вольт.

Также существуют указатели напряжения универсальные, для определения фазы и нуля, проверки наличия напряжения и с указанием ее величины от 12 до 380 В. Для работы в цепях постоянного, до 500 вольт и переменного тока, до 380 вольт. Их можно дополнительно использовать для прозвонки целостности соединений.

В данных приборах в качестве световых индикаторов используют светодиоды, а в роли источника питания конденсатор большой емкости.

Цифровой указатель напряжения имеет ЖК экран с нанесенными значениями в вольтах. При максимальном значении 220 вольт на экране светятся все значения от минимального до максимума. Т.е. данный тестер показывает приблизительное значение. Единственный плюс такой модели — отсутствие источника питания.

Бесконтактные индикаторы предназначены для обнаружения проводников под напряжением, в том числе и скрытых в стенах или панелях. Схема данного прибора реагирует на переменное электромагнитное поле, оснащена световой и звуковой индикацией. О данных устройствах мы рассказывали больше, когда говорили о том, как найти электропроводку в стене.

Правила использования

Перед использованием указателя напряжения необходимо удостовериться в его исправности. Для этого в заведомо рабочей сети нужно проверить индикацию прибора. Только после положительного результата разрешается его использовать.

Запрещено в качестве индикатора использовать лампу накаливания, ввиду ее низкой надежности, и высокой травмоопасности. При поиске фазы необходимо установить щуп указателя на интересующий проводник, прибор держать в правой руке, левую руку спрятать за спину, большим пальцем правой руки дотронутся до торцевого контакта. Это для однополюсного индикатора.

Для двухполюсного щуп с индикатором поставить на интересующий проводник или клемму, а второй щуп на ноль или соседнюю фазу. Как видно ничего сложного нет в работе с данными приборами. Помните об опасности работы под напряжением, и соблюдайте меры личной безопасности.

Напоследок рекомендуем просмотреть видео, в котором специалист рассмотрел существующие типы указателей напряжения и правила пользования данными устройствами:

Вот мы и рассмотрели виды, назначение и правила пользования указателем напряжения. Надеемся, предоставленная информация была для вас познавательной и полезной!

Будет интересно прочитать:

Указатели напряжения до 1000 В

Указатель низкого напряжения однополюсный УННО-660 СЗ

УННО-660 СЗ — однополюсный указатель низкого напряжения. Предназначен для проверки схем вторичных цепей и для определения фазного провода в электроустановках до 1000В.

В наличии: Да

Подробнее
Указатель низкого напряжения ПИН-50-1000

Указатели напряжения ПИН-50-1000 предназначены для определения наличия или отсутствие напряжения в электроустановках переменного тока, от 50 до 1000 В.

В наличии: Да

Подробнее
Указатель низкого напряжения УНН ЗПМ 24-380 (36-660)

Указатель УНН ЗПМ предназначен для определения наличия или отсутствия переменного и постоянного тока напряжением от 24 до 380В (36 до 660В).

В наличии: Да

Подробнее
Указатель низкого напряжения УНН ЗПЦ Ф 12-380 (аналог УНК-0,4)

Цифровой указатель напряжения УНН ЗПЦ Ф с функцией чередования фаз является аналогом хорошо известного УКАЗАТЕЛЯ НИЗКОГО НАПРЯЖЕНИЯ УНК-0,4

В наличии: Да

Подробнее
Указатель низкого напряжения УНН П 12-380 (аналог пробника напряжения РАТОН)

Указатель напряжения УНН П (усовершенствованный аналог ПРОБНИКА НАПРЯЖЕНИЯ РАТОН) предназначен для определения наличия или отсутствия напряжения, постоянного и переменного тока от 12 до 380В.

В наличии: Да

Подробнее
Указатель низкого напряжения УНН-1

Указатель напряжения УНН-1 предназначен для определения наличия или отсутствия напряжения от 12 до 380 В, постоянного и переменного тока.

В наличии: Да

Подробнее
Указатель низкого напряжения УННУ–1

Указатель напряжения УННУ-1 предназначен для определения наличия напряжения в электроустановках до 1000 В постоянного и переменного тока промышленной частоты 50 ГЦ.

В наличии: Да

Подробнее

Указатель напряжения: одно и двухполюсный, бесконтактный

При работе в электроустановках важно контролировать состояние цепей и токоведущих частей. Первичная проверка (в целях обеспечения безопасности) выявляет наличие или отсутствие напряжения в зоне работ. Для этого используют указатель наличия напряжения, подключаемый оператором вручную, то есть он не является элементом конструкции электроустановки.

В каких случаях обязательно надо пользоваться указателем напряжения:

  • перед началом ремонтных работ в электроустановке;
  • перед наложением переносного заземления;
  • для определения участка, на котором произошла авария;
  • для выявления токопроводящих частей электроустановки, на которых не должно быть опасного потенциала.

Важно: От правильного применения индикатора напряжения зависит безопасность, и даже жизнь электрика!

Мы рассмотрим принцип действия указателей высокого напряжения, виды и способы их применения.

Деление по типам

  1. По напряжению указатели напряжения делятся до 1000 В и свыше 1000 В. Для бытового применения обычно используются низковольтные приборы до 1 кВ. Тем не менее, это все указатели высокого напряжения. Согласно нормативам ПУЭ (Правил устройства электроустановок), безопасным для человека является напряжение переменного тока до 50 В, и постоянного тока до 120 В. При неблагоприятных условиях (влажность, токопроводящая пыль) высоким считается напряжение переменного тока до 25 В, и постоянного тока до 60 В. Указатели напряжения выше 1000 В используются профессиональными электриками, для бытовых электросетей 220 В и 380 В их применение нецелесообразно. Например, УВНУ-10 с выносной штангой.
  2. По исполнению указатели напряжения до 1000 В делятся на однополюсные и двухполюсные. Первый вариант — это скорее индикаторная отвертка, чем инструмент. Второй вариант предпочтительней, если речь идет о точности и гарантированном определении опасного потенциала.
  3. По типу электротока: для переменного или постоянного. В бытовом применении указатель высокого напряжения постоянного тока не применяется. К тому же, большинство современных индикаторов универсальные.
  4. По типу индикатора приборы могут быть неоновыми, светодиодными или цифровыми. В последнем случае можно с высокой точностью определить значение напряжения. Но это скорее сервисная, чем необходимая функция.
  5. Способ применения: контактный или бесконтактный. Первый вариант предназначен для работы с открытыми токоведущими частями, и гарантирует точное определение наличия потенциала. Бесконтактный метод используется для поиска скрытых проводок, и не может гарантировать безопасность.

Общие принципы действия УНН (указателей низкого напряжения)

Для срабатывания индикатора (вне зависимости от его типа), необходимо обеспечить протекание электротока по цепи прибора. При этом на первом месте стоит обеспечение безопасности оператора. Двухполюсная конструкция исключает прикосновение открытых участков тела к токоведущим частям. А вот однополюсный указатель напряжения, работает только при касании вспомогательного электрода пальцем. Соответственно, конструкция обязательно должна включать в себя систему ограничения тока до безопасного значения. После снижения порога тока, прибор превращается в указатель низкого напряжения, вне зависимости от реального потенциала на токоведущих частях.

  • Двухполюсные указатели представляют собой типичную электрическую цепь, где ток протекает от фазы к нулевому (или заземленному) проводнику электроустановки. Благодаря этому можно гарантировано определить наличие потенциала, и даже измерить напряжение на контрольном участке.
  • Однополюсные указатели для срабатывания индикатора используют индукционные токи, протекающие через тело оператора. Для срабатывания достаточно наличия фазы на проверяемом элементе электроустановки или проводнике. Точность невысокая, поэтому определить напряжение таким способом невозможно.

Требования к оборудованию

Для обеспечения безопасности и надежности срабатывания, подобные устройства обязательно сертифицируются. Требования государственного стандарта занимают не меньше страницы текста, выделим основные из них:

  • изоляционная оболочка прибора должна выдерживать напряжение, превышающее диапазон измерения;
  • однополюсный указатель изготавливается только в одном корпусе, при этом исключается необходимость работы двумя руками;
  • на одном конце указателя имеется щуп для контакта с проверяемым участком цепи, на противоположном — контактная площадка для касания пальцем оператора;
  • двухполюсный указатель напряжения должен состоять их двух корпусов с одинаковыми показателями защищенности, соединенными гибким изолированным кабелем длиной 1 метр;
  • открытый участок щупа не должен превышать длину, установленную для выбранного диапазона измерения;
  • световой и (или) звуковой индикатор наличия потенциала должен быть отчетливо различим в любых условиях измерения.

Стандарты безопасности единые для всей территории Российской Федерации. Никакой субъект, будь то Москва или любой областной центр не вправе смягчать требования к производству или применению подобного оборудования.

Рассмотрим работу основных типов указателей напряжения.

Двухполюсная конструкция

Указатель высокого напряжения с двумя измерительными контактами работает по принципу фиксации прохождения тока на участке цепи. Внутренняя схема сравнивает разность потенциалов между точкой измерения и заземлением (или нулевым контактом). Если порог срабатывания превышает установленное значение, срабатывает индикация.

Исполнение может быть различным, в зависимости от назначения: только индикация, поиск пробоя, измерение точного значения напряжения, установление диапазона (220 В, 380 В). В качестве примера, на иллюстрации электрическая схема прибора, определяющего наличие фазы на измеряемом участке и приблизительного порога напряжения.

Сложных интегральных элементов нет, поэтому такой указатель надежен и безотказен в любых условиях эксплуатации. Если измерения проводятся на улице, при ярком освещении — параллельно световому индикатору (в данном случае это LED элемент), добавляется звуковой.

При добавлении в измерительную цепь модуля измерения напряжения, мы получаем однорежимный мультиметр, предназначенный для безопасного измерения высокого напряжения.

Это интересно: Обычный мультиметр также можно использовать, как указатель высокого напряжения. Однако для приведения в готовность потребуется время (установка соответствующего режима измерения). Да и с безопасностью не все так гладко: специализированные приборы проходят жесткую сертификацию.

Пользоваться таким устройством несложно: пассивный контакт на соединительном проводе прикладывается к земляной (нулевой) шине электроустановки. Затем измерительным контактом надо коснуться точки замера потенциала.

Преимущества:

  • высокая точность измерения, при необходимости можно расширить функционал;
  • возможность работать с высоким напряжением без дополнительных средств защиты оператора;
  • обеспечена защита оператора: нет непосредственного контакта с открытыми участками тела.

Недостатки:

  • более высокая стоимость;
  • измеритель достаточно громоздкий.

Однополюсная конструкция

Электрический ток протекает между фазой (точка измерения) и заземляющим контуром, который обеспечивает тело человека (оператора). Внутри прибора простая электрическая цепь, состоящая из неоновой лампы и резистора. Сопротивление подбирается таким образом, чтобы электрический ток не превышал безопасное для человека значение.

В то же время, сила тока должна обеспечивать надежное срабатывание индикатора. Для неоновой лампы достаточно нескольких сотых миллиампер, так что схема работает устойчиво.

Как пользоваться таким указателем? Прибор удерживается в одной руке, палец кладется на тыльный контакт. После чего измерительный щуп прикладывается к токоведущей части электроустановки. При наличии потенциала контрольная лампа загорается.

Интересно, что различные «продвинутые» схемы с транзистором и светодиодом не так надежны, как простая неоновая лампа и графитовый резистор. Высокий процент ложных срабатываний не позволяет использовать такой прибор в профессиональных целях.

Преимущества:

  • дешевизна прибора;
  • оперативность использования;
  • возможность работать одной рукой.

Недостатки:

  • низкая точность и надежность;
  • нет расширенного функционала;
  • потенциально опасен: есть контакт открытых участков тела с измерительной частью прибора.

Бесконтактный указатель напряжения

При наличии прямого доступа к открытым контактам электропроводки или электроустановки, производить измерение напряжения легко. А как определить потенциал (хотя бы его наличие) в скрытой проводке?

Для этого существуют бесконтактные индикаторы (не путать с токоизмерительными клещами).

Такие указатели работают не напрямую с электрическим током, а с электромагнитным полем, возникающим вокруг проводника. Фактически, это трансформатор без сердечника, или катушка индуктивности.

Простейшие указатели реагируют на переменное магнитное поле. При его обнаружении срабатывает схема, собранная на триггерах, и на индикатор (LED элемент) подается напряжение. Для усиления эффекта обнаружения, параллельно включается звуковой сигнал.

Разумеется, ни о каких измерениях напряжения не может быть и речи. Мало того, наличие электромагнитного поля зависит от многих факторов, в том числе наличие рядом с проводником заземляющей шины. Иными словами, качественно (по требованиям ПУЭ) проложенный электрический кабель, бесконтактным пробником обнаружен не будет.

Важно: Использовать такой указатель в качестве детектора скрытой проводки нельзя, расстояние обнаружения составляет 1-2 см по открытому воздуху.

Преимущества:

  • удобство применения: не надо искать открытые контакты;
  • безопасность: нет контакта с токоведущими частями.

Недостатки:

  • в реальности прибор не гарантирует даже 50 % результата.

Исходя из принципа работы такого указателя, чем сильнее ток в кабеле — тем выше вероятность обнаружения потенциала. Соответственно, если электроприбор не включен, его питающий кабель не будет активно формировать вокруг себя электромагнитное поле. При этом потенциал на фазном проводе присутствует, и опасность поражения электротоком остается.

Важно: Если вы планируете использование такого указателя, все равно перед началом работ следует проверить отсутствие напряжения на открытых участках обычным контактным прибором.

Перед использованием любого измерительного прибора убедитесь в наличии сертификата соответствия безопасности.

Где купить

Чтобы максимально быстро приобрести индикатор напряжения, можно посетить ближайший специализированный магазин. Оптимальным же, по соотношению цена-качество, остаётся вариант покупки в Интернет-магазине АлиЭкспресс. Обязательное длительное ожидание посылок из Китая осталось в прошлом, ведь сейчас множество товаров находятся на промежуточных складах в странах назначения: например, при заказе вы можете выбрать опцию «Доставка из Российской Федерации»:

Видео по теме

высокого и низкого, принцип работы

Для начала монтажных или ремонтных работ на электрических станциях и проводах нужно обязательно проверить показатели сети, отсутствие тока или его параметры. Для этого используется указатель напряжения, который может определить наличие вольтажа и его совпадения до 1000в.

Описание и принцип работы

Указатель высокого напряжения и низкого – это универсальный прибор переносного типа, предназначенный для определения напряжения на токоведущих проводах или клеммах отдельных электрических устройств (УВН 10, УНК, УВНК-10, BN-020022 Profipol Benning и прочие).

Данное приспособление необходимо при работе на различных предприятиях или выезде электромонтажников на объект. Главным отличием этого указателя от стандартных измерителей является то, что он поможет определить только наличие нагрузки, но не её показатели, в отличие от моделей, которые устанавливаются на дин-рейку.

Фото — индикатор с цифровым дисплеем

 

В основном сейчас используются только устройства напряжения до 1000 Вольт, такой указатель может быть двухполюсный и однополюсный, у них схожая схема, но разные области применения. Во время работы устройства с двумя полюсами нужно подключать к двум токоведущим жилам или контактам, в то время как однополюсный только к одной. Следует знать, что двухполюсные указатели более точные, поэтому они называются высоковольтные и применяются во время сложных работ.

Фото — УН ПИН-90

 

Помимо этого также есть бесконтактный указатель. Проверка с его помощью проводится без подключения к токоведущим клеммам. Это значительно увеличивает безопасность во время определения напряжения. Устройство оснащено цифровой индикацией, причем на ней отмечается не только наличие вольтажа, но и приблизительный размер благодаря магнитному полю.

Фото — однополюсная модель

 

Бывают переносные модели на батарейках и варианты, требующие подключения к сети (например, указатель или индикатор напряжения типа Контакт 55ЭМ, УВНУ-10 кВ СЗИП, ЭЛИН-1-СЗ ВЛ). В первом случае питание осуществляется при помощи двух или более батареек, реже от аккумулятора (это УВНК, УННО, УНК, ЭИ-9000/1, Duspol digital LC, Ратон). Это позволяет использовать прибор на местности, при выезде или на ремонтных работах вдали от рабочей сети электропитания.

Фото — импортный УН DT-9902

 

Принцип работы прибора довольно простой. Во время подключения к сети (при помощи соединения с токоведущими частями) производится сравнение потенциалов. Это повышает или понижает сопротивление в резисторах указателя. Из-за этого индикатор, который потребляет самые малые доли ампер, протекающих в проводах или клеммах, загорается либо издает звуковой сигнал. Если при работе индикатор молчит – то нагрузки нет. В отдельных случаях наблюдается планомерное затухание сигнала – это значит, что в проводах была остаточная энергия.

Требования к указателям напряжения ГОСТ 20493-2001:

  1. У приборов до 1000 Вольт обязательно нагрузка индикаторов должно быть не выше 90 В;
  2. Однополюсное устройство находится в одном корпусе, в то время как двухполюсное располагается в двух, соединенных между собой шнуром;
  3. Любой указатель наличия нагрузки (бортовой, комби и прочие) должны иметь три поверхности: рабочую, изолированную, определяющую и держатель;
  4. В отдельных моделях рабочая часть соединяется с индикатором;
  5. Поверка указателей производится каждый раз перед использованием при помощи напряжения 2 кВ, при этом она длиться не более минуты.

Нужно помнить, что инструкция по безопасности требует полной подготовки перед использованием аппарата. В частности, необходимо надеть энергокомплект, включающий диэлектрические перчатки и ботинки. Эти требования указаны для электрического прибора, и они отличаются от моделей индикаторов в УАЗ, ВАЗ и прочих авто, судов и т. д.

Видео: UT 15В индикатор напряжения

Технические характеристики

Указатели напряжения для фазировки обязательно имеют сертифицированные параметры качества. Они зависят от конкретной модели прибора, рассмотрим данные на примере УННУ-40-1000:

Максимальное количество Вольт От 40 до 1000
Максимальная нагрузка индикаторов, Вольт 40
Сила тока на указателях при наибольших показателях, мА 10
Рабочее время, секунды До 10
Размер провода, м 1,0
Рабочая (без изоляции) часть указателя, длина в мм 7,0
Диапазон рабочих температур, °С
максимальная влажность, %
от -45 до +40
до 98
Максимально допустимые размеры упаковки 170х80х30
Эксплуатационный срок До 5 лет

Двухполюсный указатель рабочего напряжения типа УНН Комби имеет параметры аналогичные УННДП 12 660 (кроме максимального напряжения 660 В и рабочих температур до +35):

Рабочая нагрузка, Вольт 12 – 1000
Нагрузка индикаторов, Вольт 90
Сила тока, мА 5
Размер провода, м 1,0
Индикаторы Светодиодный, светозвуковой
Диапазон рабочих температур, °С 0 … +40
Эксплуатационный срок До 6 лет
Фото — УНН Комби

 

Схожие технические характеристики имеет двухполюсный указатель напряжения УНН 1, ПИН 90, УНК 04, Лоцман-2 и УВНИ 150 А. Их паспорт качества отличается лишь по данным нагрузки и сроку эксплуатации.

Фото — УН Лоцман-2

 

Параметры однополюсного УВН 80:

Максимальное количество Вольт 6 — 10
Диапазон рабочих температур, °С  -40 … +45
Влажность до 80
Размер ручки (в этой модели это отвертка) 120
Изоляция, мм 270

Технические данные однополюсного УВНБУ 6–35:

Напряжение, Вольт 6/35
Типы работы Контактный режим, бесконтактный режим
Ток на креплениях, мА 70
Диапазон температур От -40 до +40
Питание, Вольт 3
Диапазон действия, см 40 (в бесконтактном режиме)

Очень интересная модель УНВЛ-0,4 используется в основном на воздушных линиях электропередач. У него следующие параметры:

Нагрузка, В 25
Максимальные показатели Вольт 400
Размер провода, м 1,5
Срок эксплуатации 7 лет

Помимо этого, все модели имеют гарантию год, но только при условии регулярной проверки перед началом работы. При покупке всегда обращайте внимание на наличие данных ГОСТ, сертификата и соответствия качества и возможности проверку перед приобретением. Каждые полгода нужно производить калибровку датчика на специальном оборудовании.

Его особенностью является то, что рабочий контакт выполнен в виде крюка, который цепляется на провод независимо от высоты. Сейчас в продаже есть более новая модель для определения напряжения – это указатель УВНУ-10ФБ Поиск 1, где за крепление контактов на токоведущих частях проводов или машин отвечает штанга. Пользоваться прибором этого типа очень просто – высота регулируется при помощи ручных манипуляций, кроме того, можно зафиксировать длину выдвигающейся части.

Фото — УВНУ-10ФБ Поиск 1

 

Купить указатель напряжения можно в любом городе в специализированных электрических магазинах, но цена будет зависеть от того, кто производитель и типа прибора. Двухполюсные устройства дороже, чем однополюсники. Стоимость также варьируется от города покупки. Например, в Москве определенный УН может стоить выше, чем в Екатеринбурге или Новосибирске.

Указатель напряжения до 1000 В УННУ-1Н-Ф

Артикул: 235

9000 тг.
нет в наличии

УКАЗАТЕЛЬ НАПРЯЖЕНИЯ ДО 1000 В УННУ-1Н-Ф:

Указатель напряжения типа УННУ-1Н-Ф предназначен для определения наличия или отсутсвия напряжения в электроустановках от 40 до 1000 В постоянного и переменного тока промышленной частоты 50 Гц.

Условия эксплуатации У1 по ГОСТ 15150-69 (температура от -45°С до +40°С и относительной влажности воздуха не выше 80% при + 25°С).

Указатель позволяет определить полярность постоянного тока, на что указывает свечение светодиода у знаков «+» или «-».

При проверке напряжения переменного тока светятся оба светодиода.

Корпус, имеющий на поверности металлическую пластинку, предназначен также для определения фазы переменного тока при напряжении свыше 70 В, при этом необходимо касание рукой металлической пластинки, в этом случае загорается газоразрядная лампа, расположенная с противоположной от светодиодов стороны.

Отсутсвие свечения светодиодов исправного указателя свидетельствует об отсутсвии напряжения или обрыве проверяемой цепи.

Технические характеристики УННУ-1Н-Ф:

  • Номинальное проверяемое напряжение 40-1000 В;

  • Напряжение срабатывания не более 40 В;

  • Величина тока, протекающего через указатель при наибольшем значении рабочего напряжения не более 8 мА;

  • Длина соединительного провода не менее 1000 мм;

  • Габаритные размеры корпуса ø 25 x 160 мм;

  • Масса не более 0,14 кг.

однополюсные двухполисные, до 1000в и свыше

Персонал энергопредприятий, электрифицированных производств, электромонтажники-профессионалы и любители отлично знают о смертельной опасности тока. Так как они постоянно работают с электрооборудованием, возникает необходимость в определении наличия напряжения, ведь увидеть его в обычной обстановке нельзя. Для этого существуют специальные приборы – указатели напряжения, работающие в режиме индикации.

Проверка отсутствия напряжения

Виды указателей

Главное в распределении приборов по определенным группам это зависимость от уровня напряжения:

  • до 1000 В;
  • выше 1000 В (сюда относятся устройства 6-10, 35, 110, 220, 330 кВ).

Важно! Прибором одного вида можно работать только на тех напряжениях, для которых он предназначен.

Низковольтные устройства

Указатели напряжения до 1000в делятся на две разновидности:

  • однополюсные, служащие для определения напряжения в схемах переменного тока;
  • двухполюсные.
Однополюсные

Работа однополюсных индикаторов основана на принципе протекания емкостного тока во время замыкания цепи пальцем человека. Конструкция прибора содержит:

  • корпус из изолирующего материала;
  • рабочий контакт, или щуп;
  • сопротивление с целью ограничения напряжения;
  • газоразрядная лампа;
  • контактная поверхность на торце прибора для касания пальца.

Такой указатель низкого напряжения применяется во вторичных цепях для нахождения фазного провода. О присутствии напряжения сигнализирует загорание лампы. Образец прибора – УН 453М. Диапазон определяемых напряжений для него – от 24 В до 1,2 кВ

Указатель напряжения УН 453М

Важно! Перед использованием устройства надо выяснить его исправность прикосновением к рабочей фазе. Для полной уверенности, что тока нет, время испытания не должно быть меньше пяти секунд.

Есть другие индикаторы: iek оп-2э с парой светодиодов, которыми можно определять контактным и бесконтактным способом присутствие напряжения и наличие электромагнитного поля. Предел определяемого напряжения – 250 В.

Двухполюсные

Двухполюсный указатель напряжения состоит из двух рукояток с контактными щупами, которые присоединяются друг к другу посредствам изолированного проводника. На основной части прибора установлена газоразрядная лампа и сопротивление, на дополнительной – только сопротивление.

Индикатором напряжения ПИН 90М можно определять напряжение в однофазной и трехфазной сети. Если замеры производятся между фазой и нулевым проводом (землей), то происходит контроль фазного напряжения. Если между двумя фазными проводами – контроль линейного напряжения. Большое сопротивление лампочки, получаемое благодаря резистору, позволяет отсечь наводки.

Контроль напряжения двухполюсным указателем

Применение двухконтактного указателя напряжения ПИН 90М возможно и для цепей постоянного тока.

Другой популярный двухполюсный прибор – Контакт 55ЭМ. На корпусе главной части указателя напряжения Контакт 55ЭМ находится три светодиода, промаркированных значениями напряжения: 24, 220, 380 В. Дополнительно устройство снабжено звуковым зуммером.

Кроме светодиодов, соответствующих приблизительным показателям напряжения, Контакт 55ЭМ имеет еще электродный контакт (Ph) со светодиодной сигнализацией для определения фазного или нулевого провода.

Чтобы проконтролировать напряжение от постоянного источника, у указателя напряжения Контакт 55ЭМ в том же ряду светодиодов имеется еще один с обозначением «-», что позволяет определить «плюсовой» и «минусовой» провод. При касании основным контактным щупом «минуса», а вспомогательным «плюса» он загорится.

Контакт 55ЭМ

Важно! Недопустимо применять контрольные лампы для выяснения наличия напряжения в низковольтных цепях. Пользоваться можно только указателем напряжения.

Высоковольтные устройства

При подготовке рабочих мест на высоковольтном оборудовании производится заземление частей электроустановок. Перед этим обязательно проверяется отсутствие напряжения высоковольтным указателем.

Указатель высокого напряжения состоит из:

  • контактного наконечника;
  • газоразрядной лампочки;
  • зарядного конденсатора, обеспечивающего работу лампы.

По сравнению с низковольтными приборами, высоковольтные обладают мощной изолирующей частью, которая имеет резьбовое соединение с рукоятью. Минимально допустимые габариты изолирующей части:

  • 1-10 кВ: изолирующая часть – 23 см, рукоять – 11 см;
  • 10-20 кВ: 32 см и 11 см;
  • 35 кВ: 51 см и 12 см;
  • 110 кВ: 140 см и 60 см;
  • 110-220 кВ: 250 см и 80 см.

Указателем напряжения УВН 10 проверяют напряжение до 10 кВ.

Важно! Напряжение, при котором загорается лампочка указателя высокого напряжения УВН 10, составляет 0,25 от сетевого напряжения.

Порядок работы с указателем высокого напряжения УВН 10:

  1. Соединяются рукоять и изолирующая часть прибора;
  2. Внешним осмотром проверяется целостность изолирующей части на присутствие расслоений, трещин и прочих механических повреждений.
  3. Надеваются диэлектрические перчатки, испытанные и проверенные внешним осмотром. Без перчаток пользование прибором запрещается;
  4. Проверяется исправность УВН 10 приближением к частям электрооборудования, где присутствует напряжение. Иногда для проверки используют специальный переносной прибор;

Важно! Держать указатель допускается строго до ограничивающего рукоять кольца.

  1. Прикоснуться контактным наконечником к испытываемым частям. Если наблюдается свечение лампы, то приближаться к этой установке недопустимо.

Аналогичная конструкция у другого часто используемого указателя напряжения УВН 80. Применяют УВН 80 также до 10 кВ.

УВН 80

Указатели напряжения для проверки совпадения фаз (УВНФ) 6-10 кВ отличаются от обычных устройств. Они состоят из главной части, являющейся указателем, и дополнительной, оснащенной контактным щупом и резистором. Обе части соединяются проводом. В процессе проведения фазировки на коммутационном аппарате (выключателе) делают разрыв цепи, а на его контакты с двух сторон подают напряжение. Затем наконечниками указателя касаются однополюсных контактов по обе стороны разрыва. Свечение лампы указывает на несовпадение фаз. Отсутствие свечения говорит о правильности подсоединения фаз.

Указатель напряжения для проверки совпадения фаз

Испытания указателя

Для всех УВН устанавливаются нормы регулярных испытаний в лаборатории. Проверки должны производиться ежегодно. Испытывают состояние изоляции и напряжение зажигания сигнальной лампочки.

  1. Изолирующую часть освобождают, отсоединяя контактный щуп;
  2. Прикладывают к ней напряжение не ниже 40 кВ. Время испытания – 5 минут;
  3. Во второй части испытания напряжение на контактной части поднимают плавно до срабатывания лампочки.

Все приборы просты в использовании, но работа с ними требует осторожного отношения и выполнения мер безопасности.

Видео

Оцените статью:

Neoteck Бесконтактный тестер напряжения переменного тока Ручка, переменный ток 12-1000 В, светодиодный фонарик, зуммер для оценки живого/нулевого провода —

5.0 из 5 звезд Хорошо, если вы не знаете, проходит ли через что-то электричество
By SenseiPichu августа 22, 2021

-Это обзор ручки Neoteck AC Voltage Pen

. Мой опыт: она довольно хороша.Я заменял свои выключатели света, и я использовал это только для того, чтобы убедиться, что по проводам не течет электричество (я выключил выключатель, но вы никогда не знаете). Я также проверил, чтобы убедиться, что питание проходит через новые выключатели света. Каждый раз, когда через него проходило электричество, вы слышали звуковой сигнал, а также видели, как индикатор становится либо низким, либо высоким, в зависимости от того, какое напряжение проходит через то, против чего вы держите ручку. Он поставляется с двумя двойными батареями А, хотя они не установлены в устройстве по умолчанию, это дешевый китайский бренд, но бесплатные батареи всегда приветствуются.Он поставляется с фонариком, и это хорошо, если у вас нет ничего другого, однако вам лучше приобрести налобный фонарь или какой-либо другой источник света, поскольку тот, который идет в комплекте с ручкой, очень слабый и не очень пригодный для использования imo.

Положительный:
+ Работает
+ Поставляется с батарейками
+ Поставляется со встроенным фонариком
+ Имеет клипсу, которую можно надеть на рубашку или куда угодно
+ Пластиковый наконечник спереди позволяет безопасно прижимать его что угодно

Нейтральный:
| Было бы неплохо иметь возможность отключать громкий звуковой сигнал и выключаться только по визуальному индикатору
| Не дает вам конкретного значения напряжения, поэтому вам придется оценить, находится ли оно между 12 или 1000 В, в зависимости от того, где находится индикатор.

Отрицательный:
— Фонарик довольно слабый и не может использоваться так часто
— Если вы потеряете руководство, считайте его потерянным навсегда, так как я не могу найти его в Интернете

Рекомендуется: Если вам просто нужен индикатор, позволяющий вы знаете, что через что-то проходит электричество, тогда это, безусловно, надежная рекомендация. Если вам нужны конкретные цифры или другие подробности, поищите в другом месте.

Бесконтактный тестер напряжения и лазерный дальномер Klein Tools® 12–1000 В переменного тока — 328328

Политика доставки Онлайн-заказы на сумму 250 долларов США или более и офлайн-заказы на сумму 1000 долларов США или более будут доставлены БЕСПЛАТНО в пределах континентальной части Соединенных Штатов (применяются некоторые исключения).

  • За пределами Соединенных Штатов скидка 5% будет предоставляться при доставке заказов на Аляску, Гавайи, Виргинские острова США (Санта-Крус, Сент-Томас, Сент-Джон и Уотер-Айленд), Пуэрто-Рико и Гуам. Все остальные заказы отправляются на условиях FOB со склада Northern Safety & Industrial, если не указано иное.
  • За онлайн-заказы на сумму менее 250 долларов США и офлайн-заказы на сумму менее 1000 долларов США будет взиматься соответствующая плата за доставку и обработку в зависимости от предполагаемого веса посылки. К вашему заказу могут применяться дополнительные сборы, которые могут включать фрахт при доставке товаров, размеры упаковки, вес и дополнительные сборы.Общее количество товаров в вашем заказе будет учитываться в соответствии с нашей политикой бесплатной доставки.
  • Если вам нужен весь заказ или его часть быстро, и общая сумма заказа соответствует нашей политике бесплатной доставки, вы оплачиваете только разницу между наземными и воздушными сборами.

В настоящее время мы осуществляем доставку в Соединенные Штаты, включая адреса APO и FPO, Канаду, Виргинские острова США, Гуам и Пуэрто-Рико.

Доставка в тот же день — наши большие складские запасы и автоматизированные средства доставки позволяют нам отправлять 98% всех заказов в тот же рабочий день. Заказы, размещенные до 17:00 по восточному времени, будут отправлены в тот же рабочий день. Заказы, размещенные после 18:00 по восточному времени, будут отправлены на следующий рабочий день.

In the Fast Lane — Если вам нужен ваш заказ быстро, мы можем отправить вашу посылку на следующий день или на второй день.Выберите подходящий для вас способ при оформлении заказа.

Двухдиапазонный детектор напряжения Milwaukee 10–1000 В 2203-20

Двухдиапазонный детектор напряжения Milwaukee 10-1000 В 2203-20

Роберт Робиллард в обзорах инструментов

Детектор напряжения Milwaukee 10-1000 В, модель № 2203-20

Milwaukee постоянно пытается повысить производительность и обеспечить решение проблем, инновации на стройплощадке, это означает знание пользователя и понимание его процесса на стройплощадке.Компания Milwaukee недавно добилась этого в своем новом усовершенствованном детекторе напряжения Milwaukee 10-1000V Dual Range Voltage Detector 2203-20.

Что такое детектор напряжения?

Детектор напряжения — это устройство, которое сообщает пользователю, есть ли у объекта электрический заряд. Это может быть простое устройство для тестирования в форме ручки, которое указывает на наличие электричества, или это может быть продвинутый инструмент, такой как 2303-20, используемый для обнаружения двойных уровней напряжения в электрических системах.

Детекторы напряжения используются электриками и другими специалистами, работающими с электричеством или рядом с ним. Как подрядчик по ремонту, я всегда ношу с собой на поясе для инструментов детектор напряжения и часто им пользуюсь.

Решения для рабочих площадок и решение проблем:

Компания

Milwaukee увидела возможность улучшить свой старый вольтметр 2202-20 CAT IV 100. Они увидели, как меняется рабочая площадка благодаря новым технологиям и усилиям по охране окружающей среды, которые стимулируют рост систем сверхнизкого напряжения.В настоящее время у пользователей остались инструменты, которые не могли определять напряжения, которые становились все более распространенными. Это побудило Milwaukee разработать детектор напряжения, который четко определяет напряжение ниже 50 В без ущерба для каких-либо функциональных возможностей стандартного детектора напряжения.

Конкуренты на рынке попытались сделать это, поставив детекторы напряжения с несколькими режимами работы или несколькими кнопками, которые используются во время работы, что может создать путаницу или неуверенность во время использования.Милуоки воспринял это как возможность создать детектор напряжения с единым режимом работы, который мог бы автоматически обнаруживать и различать 10–49 В и 50–1000 В, а также работать в качестве рабочего освещения. Поставив это, пользователи теперь могут быть уверены, что им не хватает напряжения в диапазоне 10-1000 В.

Первое впечатление:

Двухдиапазонный детектор напряжения Milwaukee 10-1000 В 2203-20 имеет дизайн в виде ручки и плоский наконечник [рабочий конец] для проверки розеток.Этот детектор питается от двух батареек AAA и был разработан для обнаружения и автоматического различения 10-49 вольт переменного тока [низкое напряжение] и 50-1000 вольт переменного тока [стандартное напряжение], что позволяет широко применять его на рабочей площадке.

Датчик 2203-22 был специально разработан для бесконтактного обнаружения стандартного напряжения в кабелях, шнурах, автоматических выключателях, осветительных приборах, выключателях, розетках и проводах, а также обеспечивает обнаружение следующих общих систем, которые обычно остаются незамеченными при использовании стандартного детектор напряжения:

  • низкое напряжение в системе безопасности и доступа
  • развлечения
  • связь
  • экологический контроль
  • Светодиодное освещение
  • ирригационные системы
  • Системы обнаружения и пожаротушения
  • Системы вентиляции и кондиционирования

Использование детектора напряжения Milwaukee 2202-20:

Одна кнопка включает устройство, загорается зеленый индикатор «включено» и раздается звуковой сигнал, а также загорается яркий светодиод, который хорошо освещает рабочее пространство.Я даже использовал его в качестве фонарика — отлично работает.

Наконечник двухдиапазонного детектора напряжения Milwaukee 10-1000 В 2203-20 мигает желтым цветом и издает звуковой сигнал в унисон с мигающим светом при обнаружении напряжения от 10 до 49 вольт. Устройство мигает красным цветом и издает непрерывный звуковой сигнал при определении напряжения от 50 до 1000 вольт. Низкое напряжение мигает медленнее и медленнее слышно, а более высокое напряжение мигает быстрее и имеет непрерывный тон — вы определенно можете определить разницу между звуками.

Инструмент легкий и очень прочный.Моя старая модель 2202-20 выдержала множество падений и постоянно толкается в моих сумках с другими инструментами, а иногда и случайно включается. 2203-20 издаст 3 звуковых сигнала и выключится, если не используется, приблизительно на 5 минут. Это помогает сохранить батареи, а также полезно, когда я случайно включаю устройство, когда тянусь за другими инструментами в моей сумке для инструментов.

Особенности:

  • Автоматически различает 10–49 В и 50–1000 В
  • Одна кнопка, один режим работы
  • Светодиодные индикаторы разного цвета [желтый/красный] и звуковые сигналы определяют диапазон напряжения
  • Встроенный рабочий фонарь
  • Карманный зажим
  • Наконечник для проверки выпускных отверстий
  • Постоянная мощность горит зеленым светодиодным индикатором
  • Питание от двух батареек ААА

Двухдиапазонный детектор напряжения Milwaukee 10–1000 В — это первый бесконтактный детектор напряжения с возможностью автоматического включения, обнаружения и дифференциации.

 

границ | Оптимизация стратегий разработки генетически кодируемых индикаторов напряжения

Введение

Чтобы понять мозг, нужно понять, как отдельные нейроны обрабатывают информацию на всем пути от кончиков дендритов до сомы и далее до нервных окончаний.Реальная проблема, однако, состоит в том, чтобы расшифровать обработку информации в каждом нейроне в контексте его соседей или, другими словами, неповрежденных нейронных цепей, потому что нейронные взаимодействия составляют основу чувственного восприятия, поведения и сознания.

У млекопитающих нейронные ансамбли, состоящие из тысяч нейронов, часто участвуют в сложных процессах, таких как реконструкция визуальной сцены или маневрирование в локальной среде. Чтобы расшифровать обработку информации во время такого поведения, становится необходимым получить одновременные электрические записи паттернов активности ввода-вывода от всех участвующих нейронов с разрешением одной клетки.

Традиционная электрофизиология основана на использовании накладных электродов (внутриклеточных) и многоэлектродных матриц (МЭА) (внеклеточных) для измерения электрических событий, сопровождающих обработку нейронных сигналов. Накладные электроды могут измерять как подпороговые синаптические потенциалы, так и потенциалы действия (ПД), но могут одновременно регистрировать только несколько нейронов. MEA, с другой стороны, состоят из сотен электрических контактов и могут использоваться для одновременного получения записей напряжения от нескольких сотен нейронов.Современные внеклеточные зонды могут обеспечить почти тысячу плотно расположенных отдельных участков записи, обеспечивая высокое пространственное разрешение для электрических измерений (Jun et al., 2017). Однако синтаксический анализ сигналов от отдельных нейронов не является простым, поскольку большинство сайтов берут сигналы от нескольких нейронов. Кроме того, этот метод не позволяет проводить целевые записи в определенных клетках, типах клеток или субклеточных компартментах (Buzsaki, 2004; Spira and Hai, 2013).

Ограничения методов на основе электродов в значительной степени были смягчены оптическими подходами к мониторингу активности нейронов, такими как использование синтетических красителей и генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов.Используя последний, теперь можно одновременно однозначно регистрировать до 500 нейронов в трехмерном пространстве у бодрствующих и ведущих себя животных, сохраняя при этом клеточное разрешение с помощью методов многофотонного лазерного сканирования (Huber et al., 2012; Katona et al. ., 2012). Генетически кодируемые индикаторы могут быть сконструированы для избирательного нацеливания на определенные типы клеток и субклеточные компартменты, и делать это на определенных стадиях развития. Генетически кодируемые индикаторы кальция и вольтажа [GECI и генетически кодируемые индикаторы вольтажа (GEVI) соответственно] позволяют проводить продольную визуализацию активности меченых нейронов (Denk et al., 1996; Майнен и др., 1999; Мао и др., 2008 г.; Тиан и др., 2009 г.; Миттманн и др., 2011; Чен и др., 2012; Ваховяк и др., 2013 г.; Дана и др., 2014; Ротермель и Ваховяк, 2014 г.; Чжу и др., 2014; Lur et al., 2016), и являются методом выбора для функциональной визуализации субклеточных компартментов, например, дендритных шипиков, недоступных для электродов, и организмов, менее подходящих для экспериментов с заплатой и зажимом, таких как Drosophila и Caenorhabditis elegans . (Тиан и др., 2009; Акербум и др.., 2012; Йошихара, 2012 г.; Ковачевич и др., 2013).

Сравнение генетически кодируемых датчиков кальция и напряжения

С момента разработки в конце 1990-х годов показатели флуоресцентной активности значительно улучшились в отношении чувствительности и кинетики (Miyawaki et al., 1997; Romoser et al., 1997; Gong et al., 2015; Chamberland et al., 2017; Kannan et al., 2018; Piatkevich et al., 2018), и начинают дополнять электродные исследования для понимания фундаментальных аспектов нейрофизиологии.

Индикаторы кальция представляют собой молекулярные слияния сенсора кальция, такого как кальмодулин или тропонин С, и флуоресцентного репортерного белка (FP). GECI представляют собой цитозольные белки, которые при связывании внутриклеточного Ca 2+ претерпевают конформационные изменения, которые модулируют выход флуоресценции FP. В некоторых случаях конформационные изменения в кальций-связывающем домене вместо этого модулируют резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) между парой донорных и акцепторных флуорофоров.Современные GECI включают GCaMP и RCaMP, GECO и Cameleons (Nagai et al., 2004; Palmer et al., 2006; Tian et al., 2009; Zhao et al., 2011; Akerboom et al., 2013; Chen et al. др., 2013). Поскольку они обнаруживают внутриклеточный Ca 2+ , уровни которого колеблются во время AP, GECI обеспечивают косвенную меру надпороговой активности нейронов.

Напротив, GEVI представляют собой флуоресцентные трансмембранные белки, которые могут непосредственно воспринимать колебания напряжения на мембране во время активности и синаптической передачи.Домен, чувствительный к напряжению (VSD) в GEVI, может быть получен из трансмембранных белков, таких как ионные каналы, чувствительные к напряжению фосфатазы или микробные опсины, и слит с одним FP или парой FRET-FP (Jin et al., 2012; Gong et al., 2013, 2014; Flytzanis et al., 2014; Hochbaum et al., 2014; St-Pierre et al., 2014; Zou et al., 2014; Piao et al., 2015; Abdelfattah et al. , 2016). Зонды на основе опсина также могут функционировать как автономные GEVI, которые сообщают об активности благодаря своей природной, хотя и слабой флуоресценции (Gong et al., 2013; Флитцанис и др., 2014; Хохбаум и др., 2014).

Генетически кодируемые индикаторы напряжения проявляют зависящее от напряжения изменение флуоресценции посредством одного из двух различных механизмов: (1) за счет изменения конформации в датчике напряжения или (2) за счет связи с переходами активного состояния во время фотоцикла пигмента сетчатки, хромофора. в потенциалчувствительных опсинах. GEVI, подпадающие под категорию 1 типа, включают ArcLight, VSFP, ASAP1/2, Bongwoori и FlicR1 (Dimitrov et al., 2007; Акеманн и др., 2012; Джин и др., 2012 г.; Сен-Пьер и др., 2014 г.; Пиао и др., 2015 г.; Abdelfattah et al., 2016), тогда как части категории 2 включают производные Archaerhodopsin (Arch), такие как индикаторы QuasArs, Archers, Archons и FRET-opsin, а именно QuasArmOrange2, MacQ-mCitrine, и Ace2N-mNeon, среди прочих (Flytzanis et al., 2014; Gong et al., 2014, 2015; Hochbaum et al., 2014; Zou et al., 2014; Piatkevich et al., 2018). Различные шаблоны GEVI показаны на рисунке 1.

Рис. 1. Карикатура, показывающая различные конструкции GEVI. (A) Большинство GEVI типа 1 состоят из молекулярного слияния изолированного VSD, полученного из фосфатазы, чувствительной к потенциалу, и одной FP или пары FRET FP. В конструкциях FRET FP могут сливаться тандемно или с любым концом VSD. CFP, голубой флуоресцентный белок; YFP, желтый флуоресцентный белок. (B) GEVI типа 2 содержат автономные микробные опсины, которые имеют семь трансмембранных спиралей (Th2–TH7), или конструкции опсин-FRET, в которых опсин может быть слит с флуорофором.Микробные опсины обладают широким спектром поглощения (500–700 нм) и служат для «гашения» флуоресценции присоединенного флуорофора при колебаниях напряжения.

Как датчики мембранного потенциала, GEVI не ограничиваются обнаружением ПД в отличие от индикаторов кальция, но также могут сообщать о гиперполяризации, подпороговой деполяризации, например, связанные с синаптической передачей, и устойчивые деполяризации, которые представляют собой преходящие активированные состояния. Кроме того, в то время как индикаторы кальция демонстрируют медленную кинетику (около 50–75 мс для быстрого GECI GCaMP6f) и могут различать пики только на частоте 20 Гц или ниже (Chen et al., 2013), GEVI могут обеспечить превосходное временное разрешение, способное обнаруживать всплески на частотах выше 100 Гц (Gong et al., 2015).

Инновационный генетически закодированный индикатор напряжения

Из-за своей характерной субклеточной локализации и механизма действия критерии для разработки индикаторов напряжения по своей сути отличаются от индикаторов кальция, что создает уникальные проблемы при их разработке, разработке и тестировании.

Для индикаторов напряжения требуются надежные сигналы трафика для обеспечения адекватной и эксклюзивной мембранной экспрессии, что является предпосылкой для высокого отношения сигнал/шум (SNR) в оптических записях – отношение пика оптического отклика к стандартному отклонению базовой флуоресценции ( F 0 ).Точное субклеточное нацеливание особенно важно для индикаторов напряжения, потому что полезные сигналы напряжения возникают, но из ограниченной области клетки (мембраны) по сравнению с большим объемом цитоплазмы, доступным для обнаружения кальция.

Аналогичным образом, повышение чувствительности индикаторов напряжения является особенно сложной задачей. Чувствительность зонда на единицу изменения напряжения выражается как доля изменения флуоресценции (Δ F ) по отношению к базовой флуоресценции. Индикаторы кальция проявляют большую чувствительность, поскольку медленная кинетика последовательных переходных процессов кальция допускает кумулятивное увеличение амплитуд флуоресцентного отклика.Переходные процессы кальция, вызванные всплеском, имеют короткое время нарастания, но длительное затухание. Быстрые последовательности ПД заставляют отдельные переходные процессы суммироваться или, другими словами, накладываться друг на друга (Smetters et al., 1999). Таким образом, во время высокочастотных всплесков ПД (> ~ 20 Гц) GECI связывают накопленный кальций в течение нескольких сотен миллисекунд, намного после того, как основные спайки затухают, что приводит к длительным ответам с большим Δ F / F 0 значений. Действительно, точная кинетика (скорость включения и выключения) и динамический диапазон чувствительности индикатора зависят от его эффективной концентрации, сродства связывания Ca 2+ и клеточных буферных свойств кальция.Тем не менее, варианты GCaMP демонстрируют относительные изменения флуоресценции до 500 % для серии из 10 AP и 1000–1700 % для 160 AP в культивируемых нейронах, тогда как на самом деле их значения Δ F / F 0 для одиночных AP составляют всего 10–30% (Tian et al., 2009; Chen et al., 2013). Их высокая чувствительность in vitro также делает кальциевые зонды благоприятными для экспериментов in vivo , где они обеспечивают высокое отношение сигнал/шум на фоне фоновой флуоресценции и ослабления сигнала в толстой ткани.Потоки напряжения, с другой стороны, чрезвычайно быстрые — ПД нейрона длится менее нескольких миллисекунд. Таким образом, чувствительность GEVI измеряется как Δ F / F 0 для одной точки доступа. Современные GEVI обладают умеренной чувствительностью 40–80% Δ F / F 0 в культивируемых клетках при деполяризации 100 мВ (амплитуда AP) (Jin et al., 2012; Hochbaum et al., 2014; Piao et al. и др., 2015; Ян и др., 2016; Пяткевич и др., 2018). Ответы дополнительно ослабляются in vivo из-за фоновой флуоресценции и светорассеяния.Чтобы увеличить размер сигнала, по крайней мере, на порядок, становится неизбежным начало разработки и тестирования высокой пропускной способности.

Как прямые датчики мембранного потенциала, GEVI могут быть настроены так, чтобы быть чувствительными к гиперполяризации. Однако диапазон напряжения, в котором распространяется чувствительность пробника, может быть разным. Во многих случаях его можно сместить в сторону более негативных потенциалов путем проведения специфических мутаций в ДМЖП (Dimitrov et al., 2007; Baker et al., 2012; Piao et al., 2015). Полная оптимизация зависимости оптических характеристик от напряжения требует тщательного рассмотрения экспериментальных потребностей и соответствующей разработки датчика напряжения.

В следующих разделах мы рассмотрим характеристики идеального GEVI и текущее состояние зондов.

Локализация мембраны

Чтобы сообщать об изменениях потенциала клеточной мембраны, индикаторы напряжения должны находиться в плазматической мембране. Они используют механизм доставки секреторных белков клетки для транспортировки сюда (Lippincott-Schwartz et al., 2000). Секреторные белки, которые синтезируются и собираются в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), экспортируются в комплекс Гольджи, где подвергаются созреванию. В конечном итоге они упаковываются в везикулы пост-Гольджи и перемещаются по микротрубочкам — тонким цилиндрическим структурам, которые составляют каркас клетки. Иногда неправильно свернутые белки и белки, которые прочно связываются с шаперонами (помощниками сворачивания белков), могут быть захвачены в ER или комплекс Гольджи, что приводит к внутриклеточным агрегатам.Внося свой вклад в нечувствительную к напряжению фоновую флуоресценцию, эти агрегаты могут ослаблять SNR сигналов напряжения в оптических записях.

GEVI первого поколения FlaSh и его производные Flare, VSFP1 и SPARC, представляли собой тандемные слияния потенциалзависимых калиевых или натриевых каналов и одного FP или пары FRET-FP (Siegel and Isacoff, 1997; Sakai et al. ., 2001; Ataka and Pieribone, 2002; Baker et al., 2007). Эти GEVI проявляли интенсивную внутриклеточную агрегацию в культивируемых клетках эмбриональной почки человека (HEK) и нейронах гиппокампа с флуоресценцией менее 5% на плазматической мембране.Внутриклеточная флуоресценция часто имеет «паутинообразный» паттерн, классический фенотип, указывающий на задержку ER (Baker et al., 2007) (Рис. 2). Вероятно, из-за их плохой локализации в мембране, эти ранние зонды демонстрировали крайне низкую чувствительность к напряжению в нейронах как in vitro , так и in vivo .

Рис. 2. Конфокальные изображения экспрессии GEVI в диссоциированных нейронах гиппокампа. (A–C) GEVI на основе ионных каналов SPARC, VSFP-1 и Flare демонстрируют плохую мембранную локализацию и «паутинообразные» внутриклеточные агрегаты, что свидетельствует о задержке белка в ER. (D,E) Датчики напряжения на основе VSD Arclight и ASAP1 демонстрируют превосходную мембранную экспрессию, которая четко видна даже в субклеточных компартментах, таких как дендриты (вставки). Шкала баров = 10 мкм (Baker et al., 2007; Jin et al., 2012; St-Pierre et al., 2014).

Чтобы решить проблему агрегации, которая, как считалось, возникает из-за неправильной укладки белков мультимерных или модульных каналов, неуклюжие ионные каналы GEVI первого поколения были заменены автономным мономерным VSD трансмембранной фосфатазы, выделенной из морской брызг Ciona кишечная (сокр. Ci VSD) (Димитров и др., 2007) (рис. 2). Ci VSD представляет собой четырехпроходный трансмембранный белок (спирали S1–S4 α), который может независимо функционировать как сенсор напряжения (Murata et al., 2005).

Впоследствии ортологи других видов, таких как курица, рыбка данио, мышь, человек и лягушка, были клонированы вместо Ci VSD в качестве предполагаемых датчиков напряжения. Полученные в результате зонды демонстрируют различные характеристики: ДМЖП цыплят (сокр. Gg VSD) и рыбок данио (сокр. Dr VSD), оказывающие сильное влияние на кинетику GEVI (Baker et al., 2012; Han et al., 2013; St-Pierre et al., 2014).

Большинство GEVI на основе VSD — VSFP2, VSFP-Butterfly, Mermaid, ArcLight, Bongwoori и FlicR1 — содержат Ci VSD в качестве датчика напряжения, соединенного с зеленым или красным FP, или парой FRET-FP (Dimitrov et al. ., 2007; Tsutsui et al., 2008; Akemann et al., 2012; Jin et al., 2012; Piao et al., 2015; Abdelfattah et al., 2016). Когда пара FP или FRET слита с любым внутриклеточным концом VSD (S1 или S4), GEVI демонстрируют преобладающую локализацию в мембране в ненейрональных и гиппокампальных культурах.Мембранная локализация, по-видимому, нарушается, когда FP встраивается во внеклеточную петлю между доменами S3 и S4. Однако это не относится к аналогичной вставке FP в пределах Gg VSD в датчике быстрого напряжения ASAP1 (St-Pierre et al., 2014).

Индикаторы на основе опсина также пострадали от внутриклеточной агрегации в культивируемых нейронах и срезах мозга, что оправдывает необходимость алгоритмов взвешивания пикселей для количественной оценки флуоресцентного ответа. Эти алгоритмы выборочно усредняют изменения флуоресценции по пикселям, которые являются информативными (мембранными), при этом уменьшая вклад нечувствительного к напряжению фона (Hochbaum et al., 2014).

Помимо сенсора напряжения, выбор FP в мембранно-направленных слитых белках также влияет на экспрессию в мембране. Красные FP, такие как dsRED, mCherry и mOrange из грибной анемоны Discosoma (класс Anthozoa), имеют большую склонность к агрегации, тогда как FP, выделенные из медузы Aequorea victoria , такие как широко используемый зеленый флуоресцентный белок (GFP ) и его производные, как правило, обеспечивают лучший трафик (Arrenberg et al., 2009; Gong et al., 2014). Циклические пермутированные (cp) FP, в которых N- и C-концевые фрагменты транспонированы, чтобы сделать их более податливыми для регуляции посредством конформационных изменений, как правило, труднее сворачиваться, а зонды напряжения, включающие cpFP, имеют большую склонность к агрегации. Barnett et al., 2012; Abdelfattah et al., 2016).

Было показано, что добавление сигналов пептида экспорта ER (FCYENEV) и переноса через мембрану (KSRITSEGEYIPLDQIDINV) от калиевого канала внутреннего выпрямления K ir 2.1 к С-концу микробных опсинов уменьшает внутриклеточные агрегаты и улучшает экспрессию мембран в клетках млекопитающих. (Градинару и др., 2008, 2010). Соответственно, новые GEVI разрабатываются так, чтобы включать эти пептиды в качестве гибридных меток (Gong et al., 2014).

Наконец, при гиперэкспрессии индикаторов напряжения важно тщательно оценивать любые неблагоприятные воздействия на свойства мембраны. Поскольку GEVI вводят носители заряда в мембрану, их экспрессия, вероятно, влияет на емкость мембраны — меру заряда, хранящегося на мембране, — что, в свою очередь, может влиять на последующие физиологические процессы. Сообщается, что емкостные эффекты GEVI минимальны при обычно достигаемом уровне экспрессии.Тем не менее, важно тщательно определять свойства пассивных мембран и оценивать ширину ПД при разработке новых индикаторов (Jin et al., 2012; St-Pierre et al., 2014; Gong et al., 2015).

Чувствительность

Чувствительность оптических индикаторов является важным параметром функциональной визуализации. Как указывалось выше, при проектировании GEVI также сложнее всего улучшить.

Необходимость высокой чувствительности по напряжению

Размер оптического сигнала является важным фактором, определяющим характеристики пробника по следующим причинам.

Во-первых, чувствительность зонда напрямую влияет на ОСШ оптических сигналов. Высокое отношение сигнал-шум необходимо для надежной интерпретации данных, включая идентификацию подпороговых событий и высокоточное обнаружение пиков. Во-вторых, высокая чувствительность в предварительных скринингах с культивируемыми клетками гарантирует, что оптический сигнал будет различим на толстых срезах мозга и в экспериментах in vivo , где флуоресцентный ответ ослабляется за счет поглощения тканями, рассеяния, автофлуоресценции и флуоресценции вне фокуса. (см. раздел «Отношение сигнал/шум»).В-третьих, большие оптические сигналы позволяют избежать необходимости усреднения откликов по нескольким разверткам. Следовательно, они позволяют визуализировать в физиологических условиях, когда ответы могут варьироваться от испытания к испытанию. Зонд, дающий заметный сигнал в одиночных испытаниях, позволяет обнаруживать нестационарные события, такие как спонтанные ПД и всплески ПД.

Повышение чувствительности датчиков GEVI к напряжению

ArcLight был одним из первых описанных GEVI, демонстрирующих большую чувствительность — его выход флуоресценции снижается на целых 40 % Δ F / F 0 во время шагов деполяризации 100 мВ в клетках НЕК, 5 % в ответ на AP в культуре нейронов и острых срезах головного мозга и 2% in vivo в обонятельной луковице мыши (Jin et al., 2012; Цао и др., 2013; Кунст и др., 2014; Кляйн и др., 2015; Сторас и др., 2015). Также были разработаны индикаторы ASAP и Arch, демонстрирующие большие амплитуды отклика (Янг и др., 2016; Чемберленд и др., 2017; Пяткевич и др., 2018).

Нацеливание на FP или VSD Родительский зонд

ArcLight был сконструирован путем слияния pH-чувствительного варианта GFP, ecliptic pHluorin, с С-концом Ci VSD. Он показал предельную чувствительность -1.3% Δ F / F 0 на 100 мВ деполяризации в клетках НЕК. Впоследствии случайное открытие — непреднамеренная замена аланина аспарагиновой кислотой в положении 227 в β-стволе GFP (A227D) — привело к улучшенному варианту с Δ F / F 0 на -18%. на 100 мВ (Jin et al., 2012) (рис. 3А).

Рисунок 3. Мутации в последовательности FP, а также изменения длины линкера Ci VSD-FP влияют на чувствительность ArcLight к напряжению. (A) Реакция флуоресценции на деполяризацию 100 мВ клеток НЕК, трансфицированных Ci VSD-ecliptic pHluorin или Ci VSD-ecliptic pHluorin A227D. (B) Ступенчатые ответы 100 мВ (среднее значение ± стандартная ошибка среднего) клеток НЕК, экспрессирующих варианты 227A или 227D каждого из Ci VSD-ecliptic pHluorin, Ci VSD-eGFP или Ci VSD-SEP. (C) Кристаллическая структура eGFP (PDB ID 1EMG) с выделением A227, а также шести наиболее непохожих остатков между SEP и eGFP.Указаны версии SEP. Обратите внимание, что все четыре критических остатка 147, 227, 202 и 204 находятся на одной и той же поверхности цилиндра флуорофора. (D) Отклики флуоресценции (среднее значение ± стандартная ошибка среднего) Ci вариантов VSD-SEP, несущих мутации в указанных остатках в (C) . Эти мутации служат для замены аминокислот SEP соответствующими остатками, обнаруженными в eGFP. (E) Кривые чувствительности к рН SEP и мутантов SEP, содержащих остатки eGFP в указанных местах. (F) Средние амплитуды ответа на деполяризацию 100 мВ производных ArcLight с модифицированной длиной линкера. Группы, существенно отличающиеся от ArcLight S249, отмечены звездочками. Δ относится к датчикам, демонстрирующим плохую локализацию мембраны (Jin et al., 2012; Han et al., 2014).

Замена эклиптического рН-флюорина в ArcLight на суперэклиптический рН-флюорин (SEP), который содержит мутации F64L и S65T из улучшенного GFP (eGFP), уменьшает приобретенную чувствительность, но Δ F / F 0 можно восстановить, просто повторно введя 227D (Рисунок 3Б).Важно отметить, что замена аспарагиновой кислоты любой из 18 других аминокислот полностью или частично ослабляет оптический сигнал. Другая отрицательно заряженная аминокислота, глутаминовая кислота, содержащая дополнительный углерод, сохраняет только треть улучшенной чувствительности (-6% Δ F / F 0 на 100 мВ), что позволяет предположить, что как отрицательный заряд , так и уменьшенные стерические эффекты компактной боковой цепи аспарагиновой кислоты имеют решающее значение для реакции на напряжение (Jin et al., 2012).

В дополнение к A227D, другие остатки, специфичные для SEP и/или эклиптического pHluorin, по-видимому, играют роль в чувствительности ArcLight к напряжению. Это связано с тем, что ArcLight на основе eGFP/A227D, который отличается от SEP девятью мутациями, не может генерировать сигнал напряжения.

Исследования потери функции показывают, что на самом деле три мутации в β-стволе, уникальные для pHluorins — S147D, S202F и Q204T — необходимы для зависящего от напряжения флуоресцентного ответа ArcLight. Внедрения этих мутаций вместе с A227D достаточно, чтобы сделать датчик ArcLight на основе eGFP таким же чувствительным, как датчик на основе SEP/227D (Han et al., 2014) (рис. 3C,D).

Однако на сегодняшний день остается неясным, как эти аминокислоты преобразуют изменения напряжения во флуоресцентный сигнал. Были предложены некоторые вероятные механизмы, основанные на взаимодействии FP с мембраной, чувствительности к pH и олигомеризации.

Двухфотонная поляризационная микроскопия клеток НЕК, трансфицированных ArcLight, позволяет предположить, что SEP/227D проявляет линейный дихроизм, что означает, что флуорофор, вероятно, ориентирован параллельно поверхности мембраны.Это наблюдение вместе с данными о кристаллической структуре GFP, которые показывают, что все четыре критических остатка имеют обращенные наружу боковые цепи и принадлежат к соседним β-цепям (одна и та же поверхность) ствола GFP, позволяют нам предположить, что зависящее от напряжения конформационное изменение в Ci VSD может перемещать FP ближе к мембране и модулировать силу взаимодействия между цилиндром и мембраной. Обратимые изменения силы этих взаимодействий, в свою очередь, могут влиять на окружение хромофора и его депротонированное (флуоресцентное) состояние.

Кроме того, SEP демонстрирует изменения флуоресценции в зависимости от pH (рис. 3E). D147 служит внутренним датчиком pH, который сдвигает основание кривой чувствительности pH, приближая pKa GFP (pH при полумаксимальной флуоресценции) почти к нейтральному значению pH окружающей среды мембраны. Это также делает наклон кривой более крутым (>1). Наклон больше единицы предполагает, что даже незначительные изменения pH, которые можно было бы ожидать во время ПД, когда протоны мобилизуются электрическим полем, могут вызывать большие изменения флуоресценции.Остается неясным, действительно ли чувствительность ArcLight к напряжению связана с измерением pH SEP. Замена других FP с аналогичными кривыми pH, такими как логометрический pHluorin или YFP, не приводит к созданию чувствительных к напряжению вариантов даже в присутствии A227D. Возможно, что мутации, уникальные для SEP, имеют решающее значение для чувствительности ArcLight, и отсутствие этих мутаций может привести к быстрой буферизации небольших изменений pH. Тем не менее, чувствительность SEP к pH, по-видимому, не только модулирует отклики ArcLight, поскольку мутации в Ci VSD могут независимо настраивать его чувствительность к различным диапазонам напряжения (см. раздел «Зависимость оптических откликов от напряжения»).

Наконец, олигомеризация FP также может влиять на чувствительность к напряжению. Установка тандемного SEP после Ci VSD резко уменьшает размер отклика и меняет полярность оптического сигнала (+2% Δ F / F 0 на 100 мВ). Напротив, в индикаторе Pado, основанном на протонном канале SEP/227D, мутация предполагаемого сайта димеризации FP снижает его чувствительность, предполагая, что димеризация обычно стабилизирует оптический сигнал (Kang and Baker, 2016).Неясно, однако, существует ли SEP/227D в виде димеров в интактных GEVI, и если да, то почему димеризация имеет разные эффекты в разных каркасах.

Для более точного выяснения механизма требуется электронная микроскопия и исследования рентгеновской кристаллизации для определения структуры интактного GEVI до и во время деполяризации. Однако мембранные белки довольно сложно кристаллизуются в нативном свернутом состоянии (Parker and Newstead, 2016).

Аналогичным образом было показано, что множественные мутации в ядре опсина, расположенном вблизи хромофора, приводят к значительному улучшению чувствительности к напряжению в индикаторах, основанных на Arch (Hochbaum et al., 2014; Пяткевич и др., 2018).

Также было показано, что первичная последовательность преобразователя частоты регулирует чувствительность к напряжению. Недавно единственная мутация R415Q в спирали S4 Gg VSD в ASAP открыла новый вариант ASAP2s с поразительно высокой чувствительностью (-38% Δ F / F 0 на 100 мВ) к шагам деполяризующего напряжения. Ответ представляет собой улучшение на 66% по сравнению с родительским шаблоном ASAP1 (-23% Δ F / F 0 на 100 мВ) (Chamberland et al., 2017). Однако мутация повлияла на кинетику ответа, уменьшив время нарастания с 2,9 до 5,2 мс. Это наблюдение не совсем удивительно, учитывая, что предполагается, что движения спирали S4 участвуют в восприятии напряжения (см. раздел «Источник ДМЖП»).

Вместе эти результаты указывают на важную роль первичной аминокислотной последовательности в регулировании характеристик напряжения индикатора.

Нацеливание на компоновщик

Помимо VSD и FP, изменение длины и состава последовательности AA в линкере между двумя доменами часто приводило к резкому улучшению чувствительности к напряжению.

Укорочение линкера между спиралью S4 Ci VSD и SEP/227D удвоило амплитуду отклика ArcLight (∼35–40% против 18% Δ F / F 0 на 100 мВ). Это было достигнуто за счет усечения линкера по одной аминокислоте от остатка S249 VSD и приближения SEP к S4 до тех пор, пока оптический отклик не достигал насыщения, т.е. между позициями S243 и Q239 (рис. 3F).

Аналогичным образом замена и делеция с участием двух аминокислот (A147S ΔA148) в линкере между спиралью S3 и FP в ASAP1 увеличили его оптический сигнал до ~45% с 30% Δ F / F 0 на 50 мВ, хотя и для ответов на гиперполяризацию (Yang et al., 2016).

Датчики переноса энергии флуоресцентного резонанса в еще большей степени зависят от оптимальной длины линкера (и состава AA), поскольку эффективность FRET обратно пропорциональна шестой степени расстояния между донорными и акцепторными FP. Например, GEVI QuasAr-mOrange2 типа 2 был получен путем постепенного укорочения линкера путем усечения не только С-конца датчика напряжения с гасителем FRET QuasAr, но и N-конца донора FRET mOrange2 с последующей рандомизацией. двух остатков на пересечении (Zou et al., 2014).

Хотя уменьшение длины линкера в большинстве случаев повышает производительность, позволяя конформационным изменениям в VSD лучше проникать в FP, слишком близкое расположение двух мотивов друг к другу может также мешать их колебательной свободе и ослаблять чувствительность. Например, приближение FP к Q239 преобразователя частоты Ci снижает чувствительность ArcLight к напряжению. Более того, большие делеции в ДМЖП и/или FP могут неблагоприятно влиять на фолдинг и экспрессию белка (Han et al., 2014; Цзоу и др., 2014). Мы заметили, что нетрадиционные FP со структурой, отличной от классического ствола, как правило, требуют более длинных линкеров. Это может быть достигнуто путем введения одного или нескольких рандомизированных (NNK) кодонов в месте соединения и выбора инсерционных мутантов для повышения чувствительности к напряжению.

Полярность оптического сигнала

Большинство современных GEVI, за исключением семейства автономных опсинов Arch и FlicR1, обнаруживают снижение флуоресценции после деполяризации.Эти зонды с отрицательным наклоном зависимости напряжения от флуоресценции (кривые Δ V / Δ F ) ярче в состоянии покоя, чем во время AP. Их высокая базовая флуоресценция может быть невыгодной, поскольку флуорофоры склонны к фотообесцвечиванию даже при интенсивном окружающем освещении, а потеря флуоресценции (уменьшение количества фотонов) может отрицательно сказаться на SNR. Кроме того, флуоресценция не в фокусе от соседних покоящихся нейронов может увеличить уровень шума, еще больше ослабляя SNR, в широкопольных записях интактной ткани.Например, в исследовании обоняния in vivo у мух посторонняя флуоресценция ArcLight от некомпланарных клубочков искажала сигналы от областей интереса (ROI), включающих соответствующие клубочки на поверхности лепестков антенны. Плохое SNR приводило к пахучим реакциям, которые не соответствовали опубликованным внеклеточным записям периферических сенсилл. Проблема была частично преодолена за счет ограничения экспрессии ArcLight в определенных клубочках с помощью генетического нацеливания (Cao et al., 2013).

Низкая базовая флуоресценция, напротив, хорошо коррелирует с высокими SNR, как в случае с наиболее продвинутыми вариантами GCaMP (Chen et al., 2013). GCaMPs реагируют на AP, увеличивая выход флуоресценции по сравнению с уровнями покоя.

Недавняя работа нашей лаборатории демонстрирует, что определенные мутации FP могут изменять полярность оптического сигнала. Замена трех остатков в SEP ArcLight гидрофобными аминокислотами (D389A, h490A и Y442V) дает новый зонд с положительно наклоненной кривой Δ V / Δ F .В то время как 389A служит для изменения полярности, другие, также расположенные на той же поверхности β-цилиндра, увеличивают амплитуду отклика в том же направлении. Однако гидрофильные или полярные остатки в этих сайтах возвращают полярность к полярности ArcLight. Это открытие подтверждает аргумент о том, что чувствительные к напряжению движения в Ci VSD модулируют силу взаимодействия между FP и гидрофобной мембраной, и предполагает, что как чувствительность к напряжению, так и полярность оптических ответов могут быть изменены путем нацеливания на флуорофор (Platisa et al., 2017).

Красный индикатор напряжения FlicR1 также показывает положительную реакцию на деполяризацию (Abdelfattah et al., 2016). FlicR1 состоит из Ci VSD, объединенных с cp-mApple. Неясно, вызвано ли это изменение последовательностью и геометрией mApple, которые отличаются от семейства GFP, или его круговой перестановкой. Предыдущее исследование показало, что круговая перестановка может оказывать двунаправленное влияние на полярность, при этом некоторые каркасы на основе Ci VSD/cp-eGFP проявляют положительный, а другие отрицательный ответ на деполяризацию (Barnett et al., 2012).

Значение размера сигнала для экспериментов in vivo

Большой динамический диапазон чувствительности делает индикаторы кальция идеальными для рутинной визуализации in vivo . Напротив, было продемонстрировано, что только несколько GEVI со значительной чувствительностью работают in vivo (Cao et al., 2013; Carandini et al., 2015; Gong et al., 2015; Storace et al., 2015; Yang et al., 2015). др., 2016). Низкая чувствительность особенно проблематична для широкопольной (однофотонной) микроскопии, где флуоресценция вне фокуса снижает SNR (Flusberg et al., 2008; Мукамель и др., 2009).

ArcLight был впервые получен in vivo у Drosophila . Здесь зонд был генетически нацелен на специфические обонятельные сенсорные нейроны (OSN) путем управления экспрессией ArcLight с промоторов генов клеточно-специфических обонятельных рецепторов. Одорантную настройку пресинаптических OSN и их гломерулярных проекций изучали с помощью широкоугольной визуализации с помощью синего лазера (488 нм). Оптические сигналы собирались с частотой 125 Гц с помощью малошумящей камеры с зарядовой связью (ПЗС).Как и ожидалось из установленных электрических записей сенсилл, различные подтипы OSN, экспрессирующие ArcLight, демонстрировали возбуждающие ответы (до -5% Δ F / F 0 ) на выбор одорантов с высокой степенью одорантной настройки. Сигналы были различимы в однократных записях и сообщали об относительных различиях в силе реакции на разные одоранты и разные дозы. Например, клубочек DC2 продемонстрировал более сильную реакцию на 3-октанол, чем на 1-бутанол (-5% против -2% Δ F / F 0 ).Кроме того, ArcLight также выявил ингибирующие реакции в VA1v с аналогичной чувствительностью (Cao et al., 2013) (рис. 4).

Рисунок 4. ArcLight сообщает об ответных реакциях на одоранты в отдельных записях испытаний на Drosophila . Рис. (B) Схематическая диаграмма билатеральных антенных долей, показывающая проекции OSN, экспрессирующих Or56a, Or13a или Or47b, на соответствующие клубочки. (C) Репрезентативные оптические записи активности мембран на пресинаптических окончаниях OSN после указанного применения запаха. Желтая рамка указывает время применения запаха. Цвета указывают на различные концентрации одоранта 10, 1 или 0,1% или записи, полученные из левого (L) или правого (R) клубочков. Шкала баров = 10 мкм (панели 2 и 4) и 20 мкм (панели 1 и 3) (Cao et al., 2013).

ASAP2f, который был разработан для демонстрации высокой чувствительности и улучшенной кинетики, использовался для описания свойств зрительной реакции на лету с превосходной чувствительностью до -10% Δ F / F 0 в усредненных развертках.Данные, полученные с помощью двухфотонного микроскопа, обеспечили высокое пространственное разрешение для субклеточной визуализации (Yang et al., 2016).

Аналогично, Ace2N-mNeon, высокоскоростной индикатор FRET-опсина, состоящий из опсина Acetabularia и mNeonGreen, может сообщать о свойствах настройки ориентации в редко помеченных нейронах зрительной коры мыши с амплитудой ответа -3% Δ F / F 0 на точку доступа. Зонд, который показывает ∼-10% Δ F / F 0 на AP в культивируемых нейронах, имеет превосходную кинетику, которая компенсирует кажущуюся низкую чувствительность и увеличивает скорость обнаружения спайков in vivo (Gong et al., 2015).

Несмотря на то, что широкоугольная визуализация может ослабить SNR, смешивая оптические сигналы с флуоресценцией вне фокуса, нацеливание зондов на определенные типы клеток может свести к минимуму неспецифическое мечение и улучшить качество изображения. Такие записи с низким уровнем шума способствуют изоляции отдельных ответов в одиночных испытаниях. Кроме того, они полезны для измерения активности в определенных типах клеток, недоступных для электродов, таких как циркадные нейроны дрозофилы (Cao et al., 2013).

Оптические записи у мышей также облегчаются за счет целенаправленной экспрессии индикаторов в генетически идентифицированных популяциях, за которыми следуют истонченные препараты черепа или имплантаты черепного окна, чтобы обеспечить визуализацию через неповрежденную ткань. Однако живая визуализация у мышей влечет за собой такие проблемы, как артефакты движения от дыхания и пульсации кровеносных сосудов, гемодинамические артефакты от поглощения света (λ < 650 нм) гемоглобином и зеленая автофлуоресценция от эндогенных хромофоров никотинамидадениндинуклеотида и флавопротеинов.Все вышеперечисленное может существенно загрязнить сигналы и может быть особенно проблематичным при использовании индикаторов с синим смещением. Некоторые из этих проблем могут быть решены путем разработки зондов с красным смещением, применения стратегий временной и пространственной фильтрации или логометрической визуализации с индикаторами FRET. Однако в долгосрочной перспективе повышение чувствительности и SNR является ключом к улучшению обнаружения событий in vivo. Действительно, после описания GCaMP3 в этой области наблюдался огромный всплеск использования GECI, который затем демонстрировал достаточно большой динамический диапазон чувствительности от ~10 до ~120% Δ F / F 0 для AP и вероятности обнаружения всплесков, которые коррелируют с размерами ответов (Tian et al., 2012).

Отношение сигнал/шум

SNR сигналов напряжения обеспечивает меру точности индикатора для обнаружения частоты (и времени) отдельных пиков и подпороговых сигналов. Большой SNR позволяет обнаруживать события из отдельных испытаний, устраняя необходимость в усреднении. Отношение сигнал-шум оптических записей зависит от внутренних свойств индикатора, таких как яркость, квантовый выход и длины волн возбуждения/испускания, а также от внешних факторов, таких как экспрессия белка, перенос мембраны, интенсивность освещения, источники шума, эмиссионный фильтр, числовая апертура ( NA) объектива и выбора детектора.

Выбор флуоресцентного белка

Важным первым шагом в разработке зонда является выбор FP с высоким квантовым выходом флуоресценции (φ), яркостью, которая является произведением φ и коэффициента экстинкции (𝜀), и фотостабильностью. Такие FP, как eGFP, mNeonGreen, mCitrine и mRuby, имеют высокие значения φ (0,5–0,8) и яркости (60–90) и являются отличными зондами с высоким SNR (Jin et al., 2012; St-Pierre et al., 2014; Zou et al., 2014; Gong et al., 2015; Bajar et al., 2016). Напротив, производные Arch, которые работают как автономные GEVI, имеют флуоресценцию φ порядка от 10 -4 до 10 -3 .Хотя опсины все еще могут давать сигналы с высоким SNR при высокой интенсивности освещения (от 880 мВт мм -2 до 8 Вт мм -2 , в 18–80 раз больше, чем требуется для зондов на основе GFP) и в сочетании с чувствительным электронным умножением. -CCD или комплементарные металл-оксид-полупроводниковые (cMOS) детекторы (Flytzanis et al., 2014; Hochbaum et al., 2014), они непрактичны для изучения интактных тканей, поскольку высокая интенсивность света может вызвать нагрев образца, фотоповреждение и автофлуоресценцию ткани. С тех пор они были адаптированы в зонды опсин-FRET, где они сливаются со стандартными флуорофорами, чтобы улучшить обнаружение в стандартных условиях.

Фотостабильность, определяемая как время фотообесцвечивания до полуфлуоресценции при постоянном освещении, является еще одним фактором, ухудшающим SNR, особенно во время длительных сеансов записи. Фотостабильные зонды демонстрируют обесцвечивание от низкого до умеренного во время эксперимента и не требуют обширной коррекции обесцвечивания для изоляции сигналов. Индикаторы на основе GFP имеют тенденцию к фотообесцвечиванию быстрее, чем опсины, ограничение, связанное со свойствами доступных в настоящее время флуорофоров.

Спектральные свойства FP также влияют на SNR для изображений in vivo .Оптические сигналы, особенно от зондов с синим смещением (λ < 650 нм), склонны к затуханию из-за поглощения и рассеяния в мозге и демонстрируют низкий контраст на фоне аутофлуоресценции зеленой ткани. Зонды с красным смещением менее подвержены потерям из-за поглощения или рассеяния, а коэффициент затухания при 600–700 нм составляет примерно половину от коэффициента затухания при 500 нм. В результате их оптическое пропускание (проникновение в ткани) почти вдвое выше (Flock et al., 1992; Al-Juboori et al., 2013).

Однако следует иметь в виду, что оптические и спектральные свойства FP могут не относиться к сконструированному GEVI, поскольку слияние FP с VSD и мутация его первичной последовательности могут влиять на укладку белка и окружение хромофора, существенно изменяя нативный флуорофор.

Выражение зонда

Эксклюзивная экспрессия GEVI в плазматической мембране важна для минимизации загрязнения полезных сигналов внутриклеточной флуоресценцией, устойчивой к изменениям напряжения. В некоторой степени это может быть достигнуто путем встраивания сигналов переноса через мембрану в кодирующую последовательность или кооптации pH-чувствительных флуорофоров, таких как эклиптический pHluorin и SEP, флуоресценция которых «затмевается» в кислых внутриклеточных компартментах. Кроме того, адекватная экспрессия трансгена требует использования соответствующих векторов для доставки генов, таких как рекомбинантные аденоассоциированные вирусы (rAAV) или плазмидная ДНК для электропорации in utero .

Также важно добиться разреженной экспрессии индикаторов в отдельных нейронах, чтобы уменьшить фоновую флуоресценцию из-за ослабления SNR. Для некоторых типов нейронов, таких как кортикальные пирамидные клетки и интернейроны, специфичная для слоя экспрессия может быть достигнута путем доставки плазмидной ДНК к эмбрионам, вынашиваемым мышами, беременными по времени, с помощью электропорации in utero (Wang and Mei, 2013; De Marco Garcia and Фишелл, 2014). Определенные подтипы нейронов также могут быть нацелены на использование различий в профилях экспрессии их генов.Используя промоторы, специфичные для клеточного типа, вместе с комбинаторными стратегиями нацеливания на гены, такими как Cre recombinase/loxP или системы трансактивации тетрациклина (tTA), можно как пространственно, так и временно регулировать экспрессию индикатора.

Оптические приборы

Как и в любой флуоресцентной микроскопии, отношение сигнал/шум в функциональной визуализации также зависит от оптической установки.

Объективы с высокой числовой апертурой (ЧА) (∼1,2) могут доставлять больше фотонов возбуждения и собирать больше флуоресцентных фотонов, тем самым повышая яркость сигнала и разрешение [разрешаемое расстояние R = λ/ (2 × ЧА )] (Piston, 1998). ).В сочетании с детекторами высокого разрешения они позволяют лучше идентифицировать области интереса. Интенсивность освещения должна быть адекватной для преодоления ограничений по дробовому шуму из-за стохастических флуктуаций количества фотонов. Тем не менее, интенсивность света не должна быть чрезмерной, поскольку она может ускорить фотообесцвечивание, вызвать нагрев образца и фототоксичность. Точно так же следует тщательно выбирать эмиссионные фильтры, чтобы свести к минимуму загрязнение флуоресценции возбуждающим светом, который может резко затенить сигналы.ФП с большим стоксовым сдвигом — разницей между максимумами поглощения и излучения — полезны для избежания спектрального перекрытия (Пяткевич и др., 2010, 2013; Чу и др., 2016).

Выбор детектора — еще один фактор, который может повлиять на SNR. ПЗС-камеры, предлагаемые Redshirt Imaging, LLC, особенно подходят для высокоскоростной визуализации с частотой до 2 кГц или 5 кГц с биннингом 3 × 3 пикселя и позволяют обнаруживать оптические отклики на точки доступа. Учитывая их высокую квантовую эффективность (> 80%) — показатель процента обнаруженных фотонов — и низкий уровень шума считывания, эти камеры обеспечивают SNR, близкое к теоретическому максимуму.

Хотя обычная однофотонная микроскопия обеспечивает высокую скорость сбора данных, поскольку фотоны отбираются параллельно, двухфотонное лазерное сканирование является лучшим вариантом для получения изображений in vivo , поскольку оно обеспечивает превосходное соотношение сигнал/шум благодаря трехмерному оптическому секционированию и улучшенному пространственному разрешению. Индикаторы на основе VSD типа 1, такие как ArcLight и ASAP2f, успешно использовались для визуализации медленной динамики субклеточного напряжения in vivo (Cao et al., 2013; Storace et al., 2015; Ян и др., 2016). Например, ArcLight сообщает об одорантных реакциях в популяциях обонятельных клубочков с чувствительностью примерно от -1 до -2% Δ F / F 0 в однократных пробных записях при двухфотонной микроскопии, а также при широкопольной визуализации (Storace et al. др., 2015). Однако большое время задержки пикселей современных лазеров и низкая частота кадров (10–100 Гц) не позволяют использовать их для визуализации реакции на быстрые колебания напряжения, а именно. AP (длительность <1–2 мс). Чтобы преодолеть эту проблему, недавно было продемонстрировано, что сканирование с произвольным доступом, которое обеспечивает высокую скорость сбора данных до 1 кГц, хорошо работает с новым вариантом ASAP ASAP2.Тем не менее, несмотря на то, что высокая чувствительность ASAP2 (-15% Δ F / F на точку доступа в условиях широкопольного изображения) была воспроизведена при двухфотонной микроскопии, зонд более сильно пострадал от фотообесцвечивания во время лазерного сканирования по сравнению с однофотонным. визуализации (Chamberland et al., 2017).

Неясно, оптимизированы ли GEVI на основе опсина для двухфотонной визуализации. Недавние исследования показали, что опсиновые GEVI, такие как индикаторы на основе Arch, Ace-mNeon и MacQ-mCitrine, плохо работают под лазерной сканирующей микроскопией.Преобладающая гипотеза состоит в том, что фемтосекундный импульсный лазер, вероятно, мешает фотоциклу родопсина, а опсиновые GEVI могут не удерживаться в своем чувствительном к напряжению состоянии во время «темновой» фазы (Brinks et al., 2015; Chamberland et al., 2017).

В качестве альтернативного метода визуализации недавно было показано, что мощная волоконно-оптическая техника позволяет регистрировать динамику трансмембранного напряжения для конкретных типов клеток с использованием индикаторов опсин-FRET. Техника записи 0-D, получившая название T ransmembrane e lectrical m easurements p erformed o ptically или TEMPO, позволяет активировать флуоресценцию лазерными лучами, доставляемыми по оптическим волокнам, и регистрировать сигналы фотоприемниками. -в усилителях.Этот метод предлагает чувствительность, приближающуюся к теоретическим пределам, налагаемым фотонным шумом (Marshall et al., 2016).

В принципе, можно использовать высокоскоростную эпифлуоресцентную визуализацию для регистрации пиков in vivo , но данные потребуют серьезной постобработки, чтобы отличить ответы напряжения от фоновой флуоресценции. Кроме того, изображения по-прежнему будут давать мало пространственной информации, которую можно вывести только из обработанных сигналов. В исследовании, описывающем Ace2N-mNeon, оптические ответы на спонтанное срабатывание in vivo были зафиксированы с использованием широкоугольной визуализации со скоростью сбора данных до 2 кГц.Нейроны локализовали по электрической активности околоклеточного электрода. Изображения были подвергнуты вычитанию фона, а отклики напряжения были выборочно извлечены из пикселей, которые демонстрировали верхние 20% значений SNR, которые в основном соответствовали интересующим соматам (Gong et al., 2015).

Кинетика отклика

Улучшение скорости индикаторов напряжения для отслеживания отдельных точек доступа и разрешения быстрых последовательностей всплесков может максимизировать их полезность в исследованиях в области неврологии.Однако, как упоминалось выше, достижения в области методов визуализации должны дополнять разработку GEVI, направленную на улучшение кинетики ответа.

В ArcLight и других GEVI на основе VSD кинетика в значительной степени контролируется движениями VSD, чувствительными к напряжению. В ответ на флуктуации напряжения в ДМЖП проявляются «запирающие» движения заряда, которые, как часть нативных ионных каналов и чувствительных к напряжению фосфатаз, облегчают запирание каналов или активацию ферментов. Структурные исследования показывают, что активация напряжения Ci VSD заставляет спираль S4 скользить вверх примерно на 5 Å вдоль своей главной оси и поворачиваться примерно на 60°, чтобы мобилизовать предполагаемые заряды управления — ряд равномерно расположенных аргининов (рис. Маннуццу и др., 1996; Ян и др., 1996; Li et al., 2014) (рис. 5A,B). Предполагается, что это конформационное изменение пронизывает FP индикаторов напряжения, тем самым модулируя выход их флуоресценции.

Рис. 5. Генетически кодируемые вольтаж-индикаторы Кинетика и вольтаж-зависимость оптических ответов в значительной степени зависят от вольтаж-чувствительных конформационных изменений в его ДМЖП. (A) Кристаллическая структура VSD Ciona enteralis , чувствительной к напряжению фосфатазы (PDB ID 4G7V).Показаны четыре трансмембранные спирали S1-S4. S4 выделен красным. Положение управляющих аргининов R1–R4 (каждая третья аминокислота, начиная с 223), а также самого внешнего аргинина S4 R0 (положение 217 в Ci VSD) показаны синим цветом. Противозаряды D1 (на спирали S2), D2 и E3 (на спирали S3) обозначены красным. (B) Механическая модель измерения напряжения в Ci VSD. Активированное состояние UP сопровождается движением вниз на 5 Å S4 и вращением всей спирали на ~60° против часовой стрелки.Затем аргинины стабилизируются последовательными отрицательными зарядами от пар R1-D1, R2-D2 и R3-D3 в состоянии покоя или DOWN до R2-D1, R3-D2 и R4-E3 в конфигурации UP. (C) Выравнивание последовательностей трансмембранных сегментов VSD ортологов чувствительных к напряжению фосфатаз. Положительные, отрицательные и полярные остатки обозначены красным, синим и фиолетовым соответственно. Нумерация соответствует гомологу Ciona (Li et al., 2014; Piao et al., 2015).

Напротив, чувствительность индикаторов на основе опсина к напряжению зависит не от движений сенсора, а от изменений в протонированном состоянии хромофора сетчатки.Считается, что эти изменения происходят почти мгновенно во время переходных процессов напряжения, и в результате большинство автономных опсинов и опсин-FRET GEVI демонстрируют ускоренную кинетику в субмиллисекундных временных масштабах.

Источник ЧРП

Быстрая кинетика впервые наблюдалась в индикаторе напряжения на основе ионных каналов SPARC. SPARC состоит из скелетного натриевого канала крысы rNav1.4, слитого с eGFP, который встроен во внутриклеточную петлю между его вторым и третьим доменами. Быстрая кинетика флуоресцентного отклика (экспоненциальное время нарастания τ-вкл <1 мс; <0.5% Δ F / F 0 на 100 мВ) отражает быстрые зависящие от напряжения движения стробирующих зарядов, вероятно, в трансмембранных доменах I и II (Ataka and Pieribone, 2002).

Большинство зондов Ci на основе преобразователей частоты имеют медленное время нарастания, составляющее десятки миллисекунд, и более медленное затухание, составляющее около 80–100 мс (Dimitrov et al., 2007; Tsutsui et al., 2008; Perron et al., 2009; Jin et al. др., 2012). ArcLight-Q239, вариант с самым коротким линкером и максимальной чувствительностью, демонстрирует двойную экспоненциальную кинетику со временем включения 9 (τ1) и 48 (τ2) мс и временем выключения 17 (τ1) и 60 (τ2) мс ( на 100 мВ).Быстрые составляющие (τ1s) во время нарастания и спада составляют 50 и 80% от полной амплитуды соответственно.

Было показано, что несколько подходов изменяют кинетику зондов на основе VSD. Один из них заключался в простой замене Ci VSD на ортологи. Замена Dr VSD или Gg VSD, например, создает варианты ArcLight с более быстрой и простой кинетикой (одна экспоненциальная) с постоянными времени τ-on и τ-off ∼5 и ∼9 мс соответственно. Эти варианты, однако, демонстрируют пониженную чувствительность по сравнению с вариантом Ci VSD, предположительно из-за измененных взаимодействий между ортологами VSD и SEP 227D.Тем не менее, Куриный ArcLight может обнаруживать ПД в культивируемых нейронах в одиночных испытаниях с чувствительностью ∼-3% Δ F / F 0 и разрешать смоделированные ПД на частоте 100 Гц в клетках HEK (Han et al., 2013). ).

VSD рыбок данио и цыплят аналогичным образом повышают кинетику реакции как часть других каркасов GEVI. Например, Zahra, гибрид Dr VSD и пары CFP/YFP FRET, демонстрирует константы времени ~3,5–5 мс на деполяризацию 100 мВ, что является значительным улучшением по сравнению с его предшественником Ci на основе VSD VSFP2.1 (Димитров и др., 2007; Бейкер и др., 2012). Точно так же другой датчик на основе FRET, Mermaid, демонстрирует улучшенную кинетику, которая сравнивается с Gg VSD-ArcLight, когда Ci VSD заменяется ортологом цыпленка (Tsutsui et al., 2008; Han et al., 2013). Gg VSD также придает превосходную кинетику ASAP1/2, в котором cp-superfolder GFP встроен во внеклеточную петлю S3-S4. Хотя ASAP1/2 демонстрирует двойную экспоненциальную кинетику, в ответах преобладают быстрые компоненты (τ1 = 2 мс) (St-Pierre et al., 2014).

Напротив, VSD лягушки и человека ухудшают кинетику ArcLight, генерируя ответы медленнее, чем версия Ciona (τ-вкл = 11 и 70 мс, τ-выкл = 155 и 70 мс соответственно) (рис. 6A, B). Интересно, почему разные ортологи VSD демонстрируют различную кинетику. Частично расхождения, по-видимому, связаны с изменениями в их первичной последовательности, которые могут влиять на скорость движения стробирующих зарядов.

Рисунок 6. Изменение вида VSD или циклическая перестановка FP усиливает кинетику GEVI (A) τ-on и τ-off оптических ответов на деполяризацию 100 мВ в клетках НЕК, трансфицированных производными ArcLight на основе лягушки, курицы, ортолог чувствительной к напряжению фосфатазы рыбок данио или человека. (B) Вверху слева: конфокальное изображение культивируемых нейронов гиппокампа, экспрессирующих ArcLight курицы. Масштабная линейка = 20 мкм. Внизу слева: изображение нейрона, сделанное быстрой ПЗС-камерой 80 × 80, из которого были получены электрические и оптические записи на правой панели. ROI имеют цветовую кодировку, соответствующую цветам соответствующих оптических кривых. Справа: отдельные пробные записи вызванных ПД с использованием курицы ArcLight. Соматические записи и записи нейритов подвергались низкочастотной фильтрации с помощью гауссового фильтра 95 и 50 Гц соответственно.Нефильтрованные трассы показаны светлыми линиями. (C) Слева: широкоугольное изображение нейрона гиппокампа, экспрессирующего ElectricPk. Масштабная линейка = 15 мкм. Справа: Одиночные (светло-красная кривая) и усредненные (красная кривая) оптические и электрические ответы на вызванные ПД в нейроне слева. Оптические отклики регистрировали с помощью камеры NeuroCCD (RedShirt Imaging, LLC) на частоте 2 кГц. (D) Нормализованные кривые Δ V F для производных ArcLight A242–R217, S249–R217 и S249–Q217.242 и 249 представляют сайты слияния FP на линкере Ci VSD. 217 относится к самому внешнему аргинину на спирали S4 (Barnett et al., 2012; Han et al., 2013, 2014).

Выравнивание последовательностей ортологов VSD из 29 видов показывает, что, хотя некоторые остатки в спиралях высококонсервативны, с поразительно похожими аргининовыми повторами в S4, в некоторых из этих сайтов существуют заметные различия. Комбинаторные мутации вариабельных остатков в Ci VSD (рис. 5C) привели к развитию быстрого SEP/227D-содержащего сенсора Bongwoori. Ci VSD в Bongwoori содержит мутации в спиралях S2 и S4 (A154D/R229I), которые улучшают его кинетику, а также мутацию S4 R217Q, которая увеличивает чувствительность к отрицательным потенциалам. Зонд демонстрирует такое же τ-включение (∼8 мс), что и ArcLight, но быстрый компонент составляет большую долю общего экспоненциального затухания (91% против 50%). Его τ-off составляет 7 мс (Piao et al., 2015).

Циклическая перестановка FP

Кинетика индикатора напряжения ограничена не только движениями датчика напряжения, но также эффективностью и скоростью связи между датчиком и флуорофором во время этих движений.

Циркулярная перестановка FP, независимо от вида VSD, улучшает кинетику ответа. ElectricPK, быстрый датчик напряжения, был обнаружен во время скрининга на чувствительность к напряжению среди серии каркасов Ci VSD-cp-eGFP. Этот зонд, как и многие другие кандидаты с экрана, демонстрировал высокую скорость включения и выключения ~2 мс. ElectricPK может надежно разрешать короткие высокочастотные импульсы деполяризации в клетках HEK и AP в нейронах гиппокампа с дискретными оптическими ответами, не затуманенными накоплением дрейфа базовой линии (Barnett et al., 2012) (рис. 6С).

Точно так же слитый белок FlicR1 Ci VSD-cp-mApple демонстрирует быструю кинетику (τ1 = ~3 мс), при этом в ответах преобладают быстрые компоненты. FlicR1 был разработан путем случайного мутагенеза и содержит восемь мутаций в своем VSD. Следовательно, неясно, является ли увеличение скорости результатом только круговой перестановки или дополнительных изменений кинетики ДМЖП (Abdelfattah et al., 2016). Это также относится к ASAP1/2, где как виды VSD, так и сборка FP способствуют ускоренному измерению напряжения.

При активации напряжения Ci VSD претерпевает множественные структурные перестройки. В то время как первоначальный ответ быстрый и включает в себя движение заряда затвора, за ним следуют другие, более медленные и, вероятно, независимые от напряжения переходы. Эти два компонента динамики VSD отражены в FP и, следовательно, в флуоресцентном выходе GEVI (Kohout et al., 2008; Villalba-Galea et al., 2009). Все согласны с тем, что FP более медленных зондов напоминают оба типа движений VSD, тогда как FP более быстрых зондов фиксируют только первый.В частности, FP с круговой перестановкой эффективно сочетаются с быстрыми движениями, поскольку они более уязвимы к бочкообразным искажениям и быстро дестабилизируются из-за их неоптимальной конфигурации.

Кинетика идеального датчика напряжения

Учитывая, что ОП являются быстрыми событиями, можно предсказать, что GEVI с кинетикой менее миллисекунды может адекватно разрешать быструю последовательность ОП, предоставляя точную информацию как о частоте всплесков, так и о времени. Действительно, основанные на опсинах GEVI с субмиллисекундной кинетикой, возникающие в результате переходов состояний сетчатки в микросекундные временные масштабы, обеспечивают превосходное временное разрешение для обнаружения спайков (Maclaurin et al., 2013; Гонг и др., 2014, 2015; Цзоу и др., 2014). Однако было показано, что точность обнаружения пиков для зонда d’ зависит не от временной точности перекрытия между оптическим сигналом и формой сигнала AP, а скорее от продолжительности оптического сигнала, даже если она превышает продолжительность основного сигнала. шип (Wilt et al., 2013).

В условиях ограниченного фотонного дробового шума современные детекторы предлагают d′ , который зависит от размера сигнала Δ F / F , яркости сенсора F 0 и времени затухания сигнала τ таким образом, что d′ ≈(ΔF/F)•(F0τ)/2 (Уилт и др., 2013). Помимо улучшения чувствительности и яркости зондов, увеличение времени затухания оптического сигнала улучшает d’ , поскольку позволяет собирать дополнительные сигнальные фотоны за событие выше фона. Таким образом, оптический индикатор с быстрым подъемом, способный точно обнаруживать начало пика, но затянувшийся спад, может эффективно улучшить обнаружение пика. Тем не менее, такие индикаторы могут не обеспечивать точную информацию о времени всплесков, когда всплески достигают частот, превышающих разрешаемый предел индикатора.

Таким образом, при выборе индикатора для его кинетики отклика можно рассмотреть экспериментальные приоритеты, например, требует ли данный биологический вопрос точного обнаружения пиков, оценки времени пиков или оценки подпороговых изменений напряжения. В то время как быстрые GEVI могут хорошо подходить для первого типа вопросов, более медленные GEVI могут быть ценными инструментами для изучения входных паттернов в локальных цепях, таких как изменения напряжения в результате синаптической передачи и медленные колебания напряжения в масштабах всей популяции.

Зависимость оптических откликов от напряжения

Главной целью разработки GEVI является разработка оптических индикаторов, чувствительных как к деполяризации, так и к гиперполяризации, обеспечивающих абсолютные измерения изменения напряжения и работающих в физиологическом диапазоне напряжений для нейронов (напряжение полумаксимальной реакции флуоресценции В 1/ 2 ≈ -70 мВ). Все это может быть достигнуто за счет оптимизации кривой датчика Δ V / Δ F .

Свойства кривой Δ V F также определяются принципом измерения напряжения GEVI.Поскольку нативные ДМЖП активируются за счет деполяризации мембраны, зависимость движения заряда ворот от напряжения смещается в сторону положительных потенциалов. Это означает, что GEVI, включающие в себя ДМЖП дикого типа, будут работать только при сильном деполяризующем напряжении. Однако можно расширить диапазон чувствительности ДМЖП, включив в него менее деполяризующие и даже гиперполяризующие напряжения. Например, в калиевом канале Shaker нейтрализация самого внешнего положительного заряда в S4 (R362Q) приводит к перемещению управляющего заряда даже при напряжении ниже -70 мВ (гиперполяризация) (Seoh et al., 1996). Аналогичные мутации в VSD, полученных из фосфатазы, аналогичным образом расширяют их чувствительность, повышая полезность GEVI в широком диапазоне напряжений.

Мутация Ci VSD R217Q и соответствующие мутации Gg VSD и Dr VSD (R153Q) повышают чувствительность GEVI к гиперполяризующим потенциалам и приводят к сдвигу кривой Δ V / Δ F влево ( Рисунок 6D). Соответственно, эти мутации получили широкое распространение в ряде исследований (Dimitrov et al., 2007; Цуцуи и др., 2008 г.; Бейкер и др., 2012; Хан и др., 2013, 2014; Пиао и др., 2015). Нейтрализация встречного заряда (D164) в спирали S2 также повышает чувствительность к отрицательным напряжениям (Piao et al., 2015). Повышая чувствительность к гиперполяризации, эти мутации служат для того, чтобы поместить V 1/2 ближе к потенциалу покоящейся мембраны. На практике, однако, V 1/2 сильно варьируется в зависимости от GEVI и во многих зондах все еще имеет тенденцию к деполяризации (∼-35 до -3 мВ) (Tsutsui et al., 2008; Джин и др., 2012 г.; Пиао и др., 2015). Расхождение предполагает, что дополнительные факторы, такие как связь между VSD и FP, могут играть роль в определении зависимости оптических откликов от напряжения.

Помимо отрицательных сдвигов, наклон кривой Δ V F является еще одним индикатором чувствительности пробника при различных напряжениях. Например, датчик с большим наклоном, который показывает большую Δ F при небольших колебаниях напряжения, может быть полезен для мониторинга подпороговых изменений напряжения, тогда как GEVI с меньшим наклоном, показывающий такое же абсолютное Δ F , но при большие изменения напряжения могут быть подходящими для обнаружения пиков.По крайней мере один фактор, который, по-видимому, влияет на наклон кривой Δ V / Δ F , — это наличие заряженных остатков в S2 (Piao et al., 2015). Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы лучше понять зависимость оптических характеристик от напряжения, чтобы иметь возможность лучше адаптировать GEVI для удовлетворения конкретных экспериментальных потребностей.

Заключение

За два десятилетия, прошедшие с момента их открытия, мы начали понимать проблемы, связанные с разработкой GEVI, и стремимся создавать более совершенные зонды с улучшенной мембранной экспрессией, чувствительностью к напряжению и соотношением сигнал-шум, а также адаптируя их скорость и диапазон динамического напряжения для удовлетворения экспериментальных потребностей. .Поскольку каждый датчик GEVI обладает своими уникальными преимуществами и служит различным целям в лаборатории, может быть трудно представить себе идеальный датчик, который сочетает в себе лучшие качества всех существующих датчиков и обеспечивает единое решение для всех экспериментальных задач. Вместо этого цель разработки GEVI должна состоять в том, чтобы извлечь выгоду из потенциала данного зонда и максимизировать его полезность за счет стратегического и тщательного проектирования.

Разработка генетически закодированных индикаторов напряжения включает как минимум три этапа: разработку, поставку и диагностику.Разработка начинается с анализа кристаллических структур белка, где это возможно, и изучения больших объемов литературы для разработки предварительного каркаса. Генетическая последовательность предполагаемого индикатора напряжения затем должна быть сконструирована путем направленной эволюции, а мутанты итеративно протестированы на предмет их работоспособности. В то время как в прошлом усилия с низкой и средней пропускной способностью были сосредоточены на ручном иерархическом скрининге яркости и чувствительности к напряжению, были предприняты значительные шаги для автоматизации этих процессов и повышения пропускной способности.Теперь можно демократизировать разработку напряжения с помощью роботизированных систем и последовательно оптимизировать миллионы вариантов по нескольким параметрам, таким как яркость, локализация мембраны и чувствительность к напряжению (Пяткевич и др., 2018). Аналогичным образом, в нашей лаборатории мы разработали полуавтоматические микроскопические системы, оснащенные полевыми электродами и чувствительными детекторами для одновременной оптимизации индикаторных конструкций в формате 96-луночных планшетов для характеристик напряжения, яркости и локализации при высокой пропускной способности и высоком содержании (Kannan и другие., 2018).

После того как зонд адекватно оптимизирован для регистрации активности нейронов и охарактеризован в клеточной культуре, следующим шагом является его доставка животным для контроля его полезности в интактных цепях in vivo. Этого можно добиться путем инъекции рекомбинантных вирусов или электропорации плазмидной ДНК, кодирующей сконструированный GEVI. Выбор промотора, использование индуцибельных регуляторов экспрессии генов и время доставки генов может нацеливать экспрессию индикатора на определенные типы клеток на определенных стадиях развития.

Последний шаг – диагностика. Хотя большая часть инноваций происходит на раннем этапе открытия, диагностика, пожалуй, является наиболее творческой фазой разработки GEVI. Он включает в себя разработку экспериментальной парадигмы, которая позволяет исследовать весь спектр приложений, в которых индикатор может быть полезен. Зонд можно использовать в качестве репортера спонтанной или вызванной стимулом активности, пластичности, зависящей от развития или опыта, обучения и памяти или других форм поведения. Хирургическая и оптическая установка может также нуждаться в настройке датчика.Возможно, потребуется адекватная демонстрация новых красных и дальнекрасных индикаторов на предмет их способности мультиплексироваться с оптогенетическими инструментами с синим смещением и другими типами индикаторов с минимальными оптическими перекрестными помехами.

Разработка генетически закодированных индикаторов напряжения требует пересмотра основ механизмов, зависящих от напряжения, отличных от клеточной передачи сигналов кальция, а также понимания и оценки преимуществ датчиков напряжения, чтобы вдохновлять нас в напряженном процессе инноваций.Учитывая неуклонный прогресс в разработке зондов и ожидаемое развитие технологий визуализации, мы, вероятно, сейчас ближе к цели, чем когда-либо прежде.

Вклад авторов

MK, GV и VP написали рукопись. МК и ГВ подготовили фигуры.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Ссылки

Абдельфаттах А.С., Фархи С.Л., Чжао Ю., Бринкс Д., Цзоу П., Руангкиттисакул А. и соавт. (2016). Яркий и быстрый индикатор напряжения красного флуоресцентного белка, который сообщает об активности нейронов в органотипических срезах мозга. J. Neurosci. 36, 2458–2472. doi: 10.1523/JNEUROSCI.3484-15.2016

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Акеманн В., Муто Х., Перрон А., Парк Ю. К., Ивамото Ю. и Кнопфель Т.(2012). Визуализация динамики нейронной цепи с помощью чувствительного к напряжению флуоресцентного белка. J. Нейрофизиол. 108, 2323–2337. doi: 10.1152/jn.00452.2012

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Акербум Дж., Каррерас Кальдерон Н., Тиан Л., Вабниг С., Пригге М., Толо Дж. и др. (2013). Генетически закодированные индикаторы кальция для многоцветной визуализации нейронной активности в сочетании с оптогенетикой. Фронт. Мол. Неврологи. 6:2. дои: 10.3389/фнмол.2013.00002

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Akerboom, J., Chen, T.W., Wardill, T.J., Tian, ​​L., Marvin, J.S., Mutlu, S., et al. (2012). Оптимизация индикатора кальция GCaMP для визуализации нервной активности. J. Neurosci. 32, 13819–13840. doi: 10.1523/JNEUROSCI.2601-12.2012

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Аль-Джубури С.И., Дондзилло А., Стаблфилд Э.А., Фельсен Г., Лей Т.К. и Клуг А. (2013). Свойства светорассеяния различаются в разных областях мозга взрослой мыши. PLoS One 8:e067626. doi: 10.1371/journal.pone.0067626

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Арренберг, А. Б., Дель Бене, Ф., и Байер, Х. (2009). Оптический контроль поведения рыбок данио с помощью галородопсина. Проц. Натл. акад. науч. США 106, 17968–17973. doi: 10.1073/pnas.0

2106

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Атака, К.и Пьерибоне, В.А. (2002). Генетически нацеливаемый флуоресцентный зонд с быстрой кинетикой. Биофиз. Дж. 82, 509–516. doi: 10.1016/S0006-3495(02)75415-5

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Bajar, B.T., Wang, E.S., Lam, A.J., Kim, B.B., Jacobs, C.L., Howe, E.S., et al. (2016). Улучшение яркости и фотостабильности зеленых и красных флуоресцентных белков для визуализации живых клеток и отчетности FRET. Науч. Респ. 6:20889. дои: 10.1038/srep20889

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Бейкер, Б.Дж., Джин, Л., Хан, З., Коэн, Л.Б., Попович, М., Платиса, Дж., и соавт. (2012). Генетически кодируемые флуоресцентные датчики напряжения, использующие чувствительный к напряжению домен Nematostella и фосфатазы данио, демонстрируют быструю кинетику. J. Neurosci. Методы 208, 190–196. doi: 10.1016/j.jneumeth.2012.05.016

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Бейкер, Б.J., Lee, H., Pieribone, V.A., Cohen, L.B., Isacoff, E.Y., Knopfel, T., et al. (2007). Три датчика напряжения флуоресцентного белка демонстрируют низкую экспрессию плазматической мембраны в клетках млекопитающих. J. Neurosci. Методы 161, 32–38. doi: 10.1016/j.jneumeth.2006.10.005

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Барнетт, Л., Платиса, Дж., Попович, М., Пьерибоне, В.А., и Хьюз, Т. (2012). Флуоресцентный генетически закодированный датчик напряжения, способный определять потенциалы действия. PLoS One 7:e043454. doi: 10.1371/journal.pone.0043454

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Бринкс, Д., Кляйн, А.Дж., и Коэн, А.Е. (2015). Двухфотонная визуализация напряжения во время жизни, указывающая белки как зонд абсолютного мембранного напряжения. Биофиз. Дж. 109, 914–921. doi: 10.1016/j.bpj.2015.07.038

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Цао, Г., Платиса, Дж., Пьерибоне, В. А., Раккулья, Д., Кунст М. и Нитабах М. Н. (2013). Генетически направленная оптическая электрофизиология в интактных нейронных цепях. Сотовый 154, 904–913. doi: 10.1016/j.cell.2013.07.027

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Карандини М., Шимаока Д., Росси Л. Ф., Сато Т. К., Бенуччи А. и Кнопфель Т. (2015). Визуализация бодрствующей зрительной коры с генетически закодированным индикатором напряжения. J. Neurosci. 35, 53–63. doi: 10.1523/JNEUROSCI.0594-14.2015

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Чемберленд, С., Ян, Х. Х., Пан, М. М., Эванс, С. В., Гуан, С., Чаварха, М., и др. (2017). Быстрая двухфотонная визуализация динамики субклеточного напряжения в нейронной ткани с генетически кодируемыми индикаторами. eLife 6:e25690. doi: 10.7554/eLife.25690

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Chen, Q., Cichon, J., Wang, W., Qiu, L., Lee, S.J., Campbell, N.R., et al. (2012).Визуализация нейронной активности с использованием трансгенных мышей Thy1-GCaMP. Нейрон 76, 297–308. doi: 10.1016/j.neuron.2012.07.011

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Chen, T.W., Wardill, T.J., Sun, Y., Pulver, S.R., Renninger, S.L., Baohan, A., et al. (2013). Сверхчувствительные флуоресцентные белки для визуализации активности нейронов. Природа 499, 295–300. doi: 10.1038/nature12354

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чу, Дж., Oh, Y., Sens, A., Ataie, N., Dana, H., Macklin, J.J., et al. (2016). Яркий циан-возбудимый оранжевый флуоресцентный белок облегчает двухэмиссионную микроскопию и улучшает визуализацию биолюминесценции in vivo. Нац. Биотехнолог. 34, 760–767. doi: 10.1038/nbt.3550

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Дана, Х., Чен, Т.В., Ху, А., Шилдс, Б.С., Го, К., Лугер, Л.Л., и соавт. (2014). Трансгенные мыши Thy1-GCaMP6 для визуализации популяции нейронов in vivo. PLoS One 9:e0108697. doi: 10.1371/journal.pone.0108697

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Денк В., Юсте Р., Свобода К. и Танк Д. В. (1996). Визуализация динамики кальция в дендритных шипиках. Курс. мнение Нейробиол. 6, 372–378. doi: 10.1016/S0959-4388(96)80122-X

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Димитров, Д., Хе, Ю., Мутох, Х., Бейкер, Б.Дж., Коэн, Л., Акеманн, В., и соавт. (2007). Разработка и определение характеристик улучшенного датчика напряжения флуоресцентного белка. PLoS One 2:e0440. doi: 10.1371/journal.pone.0000440

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Flock, S.T., Jacques, S.L., Wilson, B.C., Star, W.M., and Van Gemert, MJ (1992). Оптические свойства интралипида: фантомная среда для изучения распространения света. Лазеры Surg. Мед. 12, 510–519. doi: 10.1002/lsm.1
0510

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Флюсберг, Б. А., Ниммерьян, А., Кокер, Э.Д., Мукамель, Э.А., Барретто, Р.П., Ко, Т.Х., и соавт. (2008). Высокоскоростная миниатюрная флуоресцентная микроскопия на свободно движущихся мышах. Нац. Методы 5, 935–938. doi: 10.1038/nmeth.1256

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Flytzanis, N.C., Bedbrook, C.N., Chiu, H., Engqvist, M.K., Xiao, C., Chan, K.Y., et al. (2014). Варианты архаэрродопсина с повышенной чувствительностью к напряжению флуоресценции в нейронах млекопитающих и Caenorhabditis elegans . Нац. коммун. 5:4894. doi: 10.1038/ncomms5894

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Гонг Ю., Хуанг С., Ли Дж. З., Греве Б. Ф., Чжан Ю., Эйсманн С. и соавт. (2015). Высокоскоростная запись нейронных спайков у бодрствующих мышей и мух с помощью флуоресцентного датчика напряжения. Наука 350, 1361–1366. doi: 10.1126/science.aab0810

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Гонг Ю., Вагнер М.Дж., Ли, Дж. З. и Шнитцер, М. Дж. (2014). Визуализация нервных импульсов в тканях головного мозга с использованием датчиков напряжения белка FRET-opsin. Нац. коммун. 5:3674. дои: 10.1038/ncomms4674

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Градинару, В., Томпсон, К.Р., и Дейссерот, К. (2008). eNpHR: галородопсин натрономонады, улучшенный для оптогенетического применения. Биол. клеток мозга. 36, 129–139. doi: 10.1007/s11068-008-9027-6

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Градинару, В., Zhang, F., Ramakrishnan, C., Mattis, J., Prakash, R., Diester, I., et al. (2010). Молекулярные и клеточные подходы к диверсификации и расширению оптогенетики. Сотовый 141, 154–165. doi: 10.1016/j.cell.2010.02.037

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Han, Z., Jin, L., Chen, F., Loturco, J.J., Cohen, L.B., Bondar, A., et al. (2014). Механистические исследования генетически кодируемого флуоресцентного белкового зонда напряжения ArcLight. PLoS One 9:e0113873.doi: 10.1371/journal.pone.0113873

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хан З., Джин Л., Платиса Дж., Коэн Л. Б., Бейкер Б. Дж. и Пьерибоне В. А. (2013). Зонды напряжения флуоресцентного белка, полученные из ArcLight, которые реагируют на изменения напряжения мембраны с быстрой кинетикой. PLoS One 8:e081295. doi: 10.1371/journal.pone.0081295

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хохбаум Д. Р., Чжао Ю., Farhi, S.L., Klapoetke, N., Werley, C.A., Kapoor, V., et al. (2014). Полностью оптическая электрофизиология нейронов млекопитающих с использованием модифицированных микробных родопсинов. Нац. Методы 11, 825–833. doi: 10.1038/nmeth.3000

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хубер, Д., Гутниски, Д. А., Перон, С., О’Коннор, Д. Х., Вигерт, Дж. С., Тиан, Л., и др. (2012). Множественные динамические представления в моторной коре во время сенсомоторного обучения. Природа 484, 473–478.doi: 10.1038/nature11039

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Джин, Л., Хан, З., Платиса, Дж., Вултортон, Дж. Р., Коэн, Л. Б., и Пьерибоне, В. А. (2012). Одиночные потенциалы действия и подпороговые электрические события визуализируются в нейронах с помощью зонда напряжения флуоресцентного белка. Нейрон 75, 779–785. doi: 10.1016/j.neuron.2012.06.040

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Джун, Дж. Дж., Стейнмец, Н. А., Siegle, J.H., Denman, D.J., Bauza, M., Barbarits, B., et al. (2017). Полностью интегрированные кремниевые зонды для записи нейронной активности с высокой плотностью. Природа 551, 232–236. doi: 10.1038/nature24636

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Канг, Б. Э., и Бейкер, Б. Дж. (2016). Падо, флуоресцентный белок с активностью протонных каналов, может оптически контролировать мембранный потенциал, внутриклеточный рН и картировать щелевые контакты. Науч. Реп. 6:23865.дои: 10.1038/srep23865

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Каннан М., Васан Г., Хуанг С., Хазиза С., Ли Дж. З., Инан Х. и соавт. (2018). Быстрая визуализация напряжения in vivo с использованием красного флуоресцентного индикатора. Нац. Методы 15, 1108–1116. doi: 10.1038/s41592-018-0188-7

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Katona, G., Szalay, G., Maak, P., Kaszas, A., Veress, M., Hillier, D., et al. (2012). Быстрая двухфотонная визуализация in vivo с трехмерным сканированием с произвольным доступом в больших объемах ткани. Нац. Методы 9, 201–208. doi: 10.1038/nmeth.1851

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кляйн, М., Афонсо, Б., Воннер, А. Дж., Эрнандес-Нуньес, Л., Берк, М., Табоне, С. Дж., и соавт. (2015). Сенсорные детерминанты поведенческой динамики термотаксиса дрозофилы. Проц. Натл. акад. науч. США 112, E220–E229. doi: 10.1073/pnas.1416212112

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кохут, С.C., Ulbrich, MH, Bell, S.C., and Isacoff, E.Y. (2008). Организация субъединиц и функциональные переходы в Ci-VSP. Нац. Структура Мол. биол. 15, 106–108. дои: 10.1038/nsmb1320

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ковачевич И., Ороско Дж. М. и Крам Э. Дж. (2013). Филамин и фосфолипаза С-эпсилон необходимы для передачи сигналов кальция в сперматеках Caenorhabditis elegans . Генетика PLoS. 9:e1003510. дои: 10.1371/journal.pgen.1003510

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кунст, М., Хьюз, М.Е., Раккулья, Д., Феликс, М., Ли, М., Барнетт, Г., и соавт. (2014). Пептидные нейроны, связанные с геном кальцитонина, опосредуют специфический для сна циркадный выброс у дрозофилы. Курс. биол. 24, 2652–2664. doi: 10.1016/j.cub.2014.09.077

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ли К., Вандерлинг С., Падуч М., Медовой Д., Сингарой А., Mcgreevy, R., et al. (2014). Структурный механизм зависящего от напряжения стробирования в изолированном домене, чувствительном к напряжению. Нац. Структура Мол. биол. 21, 244–252. doi: 10.1038/nsmb.2768

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Липпинкотт-Шварц, Дж., Робертс, Т.Х., и Хиршберг, К. (2000). Транспорт секреторных белков и динамика органелл в живых клетках. год. Преподобный Cell Dev. биол. 16, 557–589. doi: 10.1146/annurev.cellbio.16.1,557

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Лур, Г., Винк, М. А., Танг, Л., Кардин, Дж. А., и Хигли, М. Дж. (2016). Кодирование визуальных признаков, специфичных для проекции, подсетями коры 5 слоя. Cell Rep. 14, 2538–2545. doi: 10.1016/j.celrep.2016.02.050

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Маклорин, Д., Венкатачалам, В., Ли, Х., и Коэн, А. Э. (2013). Механизм потенциалчувствительной флуоресценции микробного родопсина. Проц. Натл. акад. науч. США 110, 5939–5944. doi: 10.1073/pnas.1215595110

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Майнен З.Ф., Малинов Р. и Свобода К. (1999). Переходные процессы синаптического кальция в отдельных шипах указывают на то, что рецепторы NMDA не насыщены. Природа 399, 151–155. дои: 10.1038/20187

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Маннуццу, Л. М., Моронн, М. М., и Исакофф, Э.Ю. (1996). Прямая физическая мера конформационной перестройки, лежащей в основе блокировки калиевых каналов. Наука 271, 213–216. doi: 10.1126/наука.271.5246.213

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мао, Т., О’Коннор, Д. Х., Шойсс, В., Накаи, Дж., и Свобода, К. (2008). Характеристика и субклеточное нацеливание на генетически кодируемые индикаторы кальция типа GCaMP. PLoS One 3:e01796. doi: 10.1371/journal.pone.0001796

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Маршалл, Дж.D., Li, J.Z., Zhang, Y., Gong, Y., St-Pierre, F., Lin, M.Z., et al. (2016). Оптическая запись динамики мембранного напряжения у свободно движущихся мышей в зависимости от типа клеток. Сотовый 167, 1650–1662.e15. doi: 10.1016/j.cell.2016.11.021

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Mittmann, W., Wallace, D.J., Czubayko, U., Herb, J.T., Schaefer, A.T., Looger, L.L., et al. (2011). Двухфотонная кальциевая визуализация вызванной активности соматосенсорных нейронов L5 in vivo. Нац. Неврологи. 14, 1089–1093. doi: 10.1038/nn.2879

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мияваки, А., Ллопис, Дж., Хейм, Р., Маккаффери, Дж. М., Адамс, Дж. А., Икура, М., и соавт. (1997). Флуоресцентные индикаторы Ca2+ на основе зеленых флуоресцентных белков и кальмодулина. Природа 388, 882–887. дои: 10.1038/42264

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мукамель, Э. А., Ниммерьян, А., и Шнитцер, М.Дж. (2009). Автоматизированный анализ клеточных сигналов из крупномасштабных данных визуализации кальция. Нейрон 63, 747–760. doi: 10.1016/j.neuron.2009.08.009

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мурата Ю., Ивасаки Х., Сасаки М., Инаба К. и Окамура Ю. (2005). Активность фосфоинозитидфосфатазы в сочетании с датчиком внутреннего напряжения. Природа 435, 1239–1243. doi: 10.1038/nature03650

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Нагаи, Т., Ямада С., Томинага Т., Итикава М. и Мияваки А. (2004). Расширен динамический диапазон флуоресцентных индикаторов для Ca(2+) за счет циклически пермутированных желтых флуоресцентных белков. Проц. Натл. акад. науч. США 101, 10554–10559. doi: 10.1073/pnas.0400417101

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Палмер, А. Э., Джакомелло, М., Кортемме, Т., Хайрес, С. А., Лев-Рам, В., Бейкер, Д., и соавт. (2006). Индикаторы Ca2+ основаны на компьютерно переработанных парах кальмодулин-пептид. Хим. биол. 13, 521–530. doi: 10.1016/j.chembiol.2006.03.007

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Паркер, Дж. Л., и Ньюстед, С. (2016). Кристаллизация мембранных белков: современные тенденции и перспективы на будущее. Доп. Эксп. Мед. биол. 922, 61–72. дои: 10.1007/978-3-319-35072-1_5

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Перрон А., Мутох Х., Акеманн В., Гаутам С.Г., Димитров Д., Iwamoto, Y., et al. (2009). Чувствительные к напряжению флуоресцентные белки второго и третьего поколения для мониторинга мембранного потенциала. Фронт. Мол. Неврологи. 2:5. doi: 10.3389/neuro.02.005.2009

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Пиао, Х. Х., Раджакумар, Д., Канг, Б. Е., Ким, Э. Х., и Бейкер, Б. Дж. (2015). Комбинаторный мутагенез домена, чувствительного к напряжению, обеспечивает оптическое разрешение потенциалов действия, возбуждающихся с частотой 60 Гц, с помощью генетически кодируемого флуоресцентного сенсора мембранного потенциала. J. Neurosci. 35, 372–385. doi: 10.1523/JNEUROSCI.3008-14.2015

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Пяткевич, К.Д., Хулит, Дж., Субах, О.М., Ву, Б., Абдулла, А., Сегалл, Дж.Е., и соавт. (2010). Мономерные красные флуоресцентные белки с большим стоксовым сдвигом. Проц. Натл. акад. науч. США 107, 5369–5374. doi: 10.1073/pnas.0

5107

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Пяткевич К.D., Jung, E.E., Straub, C., Linghu, C., Park, D., Suk, H.J., et al. (2018). Роботизированный подход к многомерной направленной эволюции применительно к флуоресцентным репортерам напряжения. Нац. хим. биол. 14, 352–360. doi: 10.1038/s41589-018-0004-9

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Пяткевич К.Д., Малашкевич В.Н., Морозова К.С., Немкович Н.А., Алмо С.К., Верхуша В.В. (2013). Расширенный стоксов сдвиг во флуоресцентных белках: хромофор-белковые взаимодействия в варианте TagRFP675 в ближнем инфракрасном диапазоне. Науч. Респ. 3:1847. дои: 10.1038/srep01847

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Платиса Дж., Васан Г., Ян А. и Пьерибоне В. А. (2017). Направленная эволюция ключевых остатков во флуоресцентном белке меняет полярность чувствительности к напряжению в генетически закодированном индикаторном дуговом свете. ACS Хим. Неврологи. 8, 513–523. doi: 10.1021/acschemneuro.6b00234

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ромосер, В.А., Хинкль П.М. и Персечини А. (1997). Выявление в живых клетках Са2+-зависимых изменений свечения флуоресценции индикатора, состоящего из двух вариантов зеленого флуоресцентного белка, связанных кальмодулин-связывающей последовательностью. Новый класс люминесцентных индикаторов. Дж. Биол. хим. 272, 13270–13274. doi: 10.1074/jbc.272.20.13270

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Сакаи, Р., Репунте-Канониго, В., Радж, К.Д., и Нопфель, Т. (2001). Дизайн и характеристика ДНК-кодируемого, чувствительного к напряжению флуоресцентного белка. евро. Дж. Нейроски. 13, 2314–2318. doi: 10.1046/j.0953-816x.2001.01617.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Seoh, S.A., Sigg, D., Papazian, D.M., and Bezanilla, F. (1996). Остатки, чувствительные к напряжению, в сегментах S2 и S4 канала Shaker K+. Нейрон 16, 1159–1167.

Реферат PubMed | Академия Google

Siegel, M.S., and Isacoff, E.Y. (1997). Генетически закодированный оптический зонд мембранного напряжения. Нейрон 19, 735–741. doi: 10.1016/S0896-6273(00)80955-1

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Сторас, Д. А., Браубах, О. Р., Джин, Л., Коэн, Л. Б., и Сун, У. (2015). Мониторинг активности мозга с помощью белкового напряжения и датчиков кальция. Науч. Респ. 5:10212. дои: 10.1038/srep10212

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сен-Пьер Ф., Маршалл Дж. Д., Ян Ю., Гонг Ю., Шнитцер М. Дж. и Лин М.З. (2014). Высокоточные оптические отчеты об электрической активности нейронов с помощью сверхбыстрого флуоресцентного датчика напряжения. Нац. Неврологи. 17, 884–889. doi: 10.1038/nn.3709

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Тиан, Л., Хайрс, С.А., и Лугер, Л.Л. (2012). Визуализация активности нейронов с помощью генетически закодированных индикаторов кальция. Гавань Колд Спринг. протокол 2012, 647–656. doi: 10.1101/pdb.top069609

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Тиан, Л., Hires, S.A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M.E., Chalasani, S.H., et al. (2009). Визуализация нейронной активности у червей, мух и мышей с улучшенными показателями кальция GCaMP. Нац. Методы 6, 875–881. doi: 10.1038/nmeth.1398

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Цуцуи Х., Карасава С., Окамура Ю. и Мияваки А. (2008). Улучшение измерений мембранного напряжения с использованием FRET с новыми флуоресцентными белками. Нац. Методы 5, 683–685.doi: 10.1038/nmeth.1235

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Вильяльба-Галеа, К.А., Сандтнер, В., Димитров, Д., Мутох, Х., Кнопфель, Т., и Безанилла, Ф. (2009). Движение заряда чувствительного к напряжению флуоресцентного белка. Биофиз. Дж. 96, Л19–Л21. doi: 10.1016/j.bpj.2008.11.003

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ваховяк, М., Экономо, М. Н., Диас-Кесада, М., Брунерт, Д., Вессон, Д. В., Уайт, Дж.А. и др. (2013). Оптическое исследование обработки информации о запахах in vivo с использованием GCaMP, экспрессируемых в определенных типах клеток обонятельной луковицы. J. Neurosci. 33, 5285–5300. doi: 10.1523/JNEUROSCI.4824-12.2013

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Уилт, Б. А., Фитцджеральд, Дж. Э., и Шнитцер, М. Дж. (2013). Фотонный дробовой шум ограничивает оптическое обнаружение нейронных спайков и оценку времени спайка. Биофиз. J. 104, 51–62.doi: 10.1016/j.bpj.2012.07.058

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Yang, H.H., St-Pierre, F., Sun, X., Ding, X., Lin, M.Z., and Clandinin, T.R. (2016). Субклеточная визуализация сигналов напряжения и кальция показывает нейронную обработку в естественных условиях. Сотовый 166, 245–257. doi: 10.1016/j.cell.2016.05.031

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ян, Н., Джордж, А.Л. младший, и Хорн, Р. (1996). Молекулярные основы движения заряда в потенциалзависимых натриевых каналах. Нейрон 16, 113–122. doi: 10.1016/S0896-6273(00)80028-8

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Чжао Ю., Араки С., Ву Дж., Терамото Т., Чанг Ю. Ф., Накано М. и др. (2011). Расширенная палитра генетически кодируемых индикаторов Ca(2)(+). Наука 333, 1888–1891. doi: 10.1126/science.1208592

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжу, Ю., Сюй, Дж., Хаусвирт, В.В., и Деврис, С.Х. (2014). Генетически направленная бинарная маркировка нейронов сетчатки. J. Neurosci. 34, 7845–7861. doi: 10.1523/JNEUROSCI.2960-13.2014

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Зоу, П., Чжао, Ю., Дуглас, А.Д., Хохбаум, Д.Р., Бринкс, Д., Верли, К.А., и соавт. (2014). Яркие и быстрые разноцветные репортеры напряжения через электрохромный FRET. Нац. коммун. 5:4625. doi: 10.1038/ncomms5625

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лучшие тестеры напряжения 2022 года

Фото: amazon.com

Если вы занимаетесь электрическими проектами в доме, необходимо иметь наготове определенные предметы первой необходимости. В то время как плоскогубцы, инструменты для зачистки проводов и хорошая отвертка могут помочь вам достичь результатов профессионального уровня, наличие лучшего тестера напряжения под рукой ускорит ваш рабочий процесс и защитит вас от ударов.

Тестеры напряжения позволяют быстро, легко и безопасно проверить питание. Большинство из них очень просты в использовании: нажмите кнопку включения и удерживайте ее рядом с нужными проводами.Он укажет, обнаруживает ли он питание, и вы сможете действовать соответствующим образом. Тестеры напряжения экономят время и могут помочь вам избежать болезненного и опасного удара током, но, поскольку существуют различные типы тестеров напряжения, это руководство поможет вам выбрать модель, наиболее подходящую для ваших нужд. Читайте дальше, чтобы узнать, как делать покупки с умом, и узнайте, почему следующие инструменты являются одними из лучших тестеров напряжения, которые вы можете купить.

  1. ЛУЧШИЙ В ОБЩЕМ ОБЪЕКТЕ: Fluke 1AC-A1-II VoltAlert Бесконтактный тестер напряжения
  2. ЛУЧШИЙ ОТДАЧА: Sperry Instruments STK001 Бесконтактный тестер напряжения
  3. 90 PRO Электрический тестер
  4. МНОГОФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ЛЮБИМЫЙ: Klein Tools NCVT-4IR Тестер напряжения
  5. ЛУЧШИЙ КАРМАННЫЙ РАЗМЕР: Карманный детектор напряжения Fluke FLK2AC/90-1000V
com

Что следует учитывать при выборе лучшего тестера напряжения

Ниже приведены наиболее важные факторы, которые следует учитывать при выборе тестера напряжения, включая дизайн и функции.

Конструкция

Существует три основных конструкции тестеров напряжения: пробники, тестеры розеток и мультиметры.

  • Тестер пера размером и формой примерно напоминает толстую ручку или маркер. Для работы просто включите его и коснитесь соответствующего провода.Вы также можете поместить наконечник в розетку, чтобы проверить напряжение.
  • Тестер розеток размером примерно с электрическую вилку и подключается непосредственно к розетке. Они могут проверить напряжение (и, как правило, полярность, чтобы убедиться, что розетка подключена правильно), но не могут проверить цепи вне розетки.
  • Мультиметры с тестерами напряжения — лучшее из обоих миров, хотя они значительно больше, чем тестер пера или розетки.У них есть канавки или крючки, чтобы окружить провод и определить напряжение, а также выводы (провода и точки, подключенные к тестеру) для проверки контактов, таких как розетки и клеммы.

Функциональность

Как правило, тестеры напряжения используются только для проверки переменного тока, например, электричества в жилом или коммерческом здании. Они бесполезны для обнаружения постоянного тока в транспортном средстве.

Но это не значит, что все тестеры напряжения — универсальные пони.Некоторые пен-тестеры имеют встроенные функции, такие как фонарики, измерительные лазеры и инфракрасные термометры. Многие тестеры розеток могут предупредить вас, если проводка розетки перевернута. Мультиметры могут проверять напряжение переменного и постоянного тока, а также сопротивление, силу тока и многое другое.

Индивидуальные потребности каждого пользователя определяют, какие функции необходимы в детекторе напряжения. Чтобы просто проверить провод на наличие питания, тестер пера может сделать свое дело, не путая кнопки или переключатели. Если вы занимаетесь различными электрическими проектами, мультиметр может стать настоящим подспорьем.

Совместимость

Тестеры напряжения совместимы не со всеми электрическими устройствами, с которыми вы можете столкнуться. Определенные типы напряжения или напряжения за пределами диапазона, который тестер может обнаружить, не вызовут предупреждения тестера.

Ручки и тестеры розеток отлично подходят для проверки электричества в доме, включая выключатели, розетки и светильники, но обычно они бесполезны, когда дело доходит до проверки проблем с электрической системой автомобиля. Многие пен-тестеры также имеют рабочие диапазоны напряжения, например от 90 до 1000 В, поэтому некоторые из них могут не обнаруживать низкие напряжения.

Если вы занимаетесь ремонтом электронных устройств (например, компьютеров, дронов или телевизоров) или ремонтом транспортных средств, ищите мультиметр со встроенным тестером напряжения. Мультиметр может переключаться между переменным и постоянным током, а также проверять сопротивление и силу тока.

Долговечность

Для длительного использования и надежности выберите тестер напряжения от одного из надежных производителей электроинструмента. Эти компании специализируются на создании электроинструментов для профессионалов, и их продукция является первоклассной — многие профессионалы до сих пор используют измерители и тестеры, которые они приобрели несколько десятилетий назад.

Срок службы батареи также имеет значение. Многие из лучших тестеров напряжения имеют функцию автоматического отключения. Если они не обнаружат напряжение в течение определенного периода времени (обычно около 15 минут), тестер автоматически отключится, чтобы продлить срок службы батареи.

Наш выбор

Теперь, когда вы знаете немного больше о том, что нужно для выбора лучшего тестера напряжения, вы готовы приступить к покупкам. Ниже вы найдете подробную информацию о некоторых из лучших тестеров напряжения на рынке — все они производятся проверенными брендами, производящими качественные электроинструменты.

Фото: amazon.com

Обратите внимание на бесконтактный тестер напряжения Fluke 1AC-A1-II VoltAlert — качественный тестер от лидера в области электрических испытаний. Этот тестер может определять напряжение от 90 до 1000 вольт, удобно помещаясь в сумке для инструментов или в кармане. Когда он обнаруживает напряжение, наконечник светится ярко-красным в качестве предупреждения.

1AC-A1-II имеет индикатор непрерывной самопроверки, который мигает красным, чтобы предупредить о том, что он работает. Он также издает громкий звуковой сигнал, указывающий на мощность обнаружения, но есть функция отключения для тихих условий.Он работает от двух батареек типа ААА и имеет функцию автоматического отключения для экономии заряда батареи.

Pro Pros

  • Pocket-Size
  • Простая и надежная система обнаружения
  • длительный срок службы батареи

минусов

  • Высокая чувствительность может не идентифицировать отдельные провода

Фото: Amazon.com

Бесконтактный тестер напряжения STK001 от Sperry Instruments представляет собой надежный и экономичный тестер напряжения.Этот тестер пера поставляется с тестером вставных розеток, позволяющим тестировать провода и розетки с помощью одного комплекта.

Тестер пера определяет напряжение от 50 до 1000 вольт. Когда он обнаружит напряжение, он издаст громкий звуковой сигнал, а прозрачный пластик, в котором находится лампочка, начнет мигать красным. Он работает от одной батареи AAA и имеет индикатор низкого заряда батареи, чтобы вы знали, что он работает. Тестер розеток предупредит вас о напряжении, а также об открытых заземлениях, разомкнутых нейтралях, разомкнутых горячих точках и обратной полярности. Он также может тестировать розетки прерывателя цепи замыкания на землю (GFCI), чтобы убедиться, что они работают правильно.

Pro Pros

  • Доступные
  • Тесты
  • Произображения
  • Произображения
  • Также тесты единицы GFCI

минус

    • Слишком чувствительные к проводам Trace

    Фото: Amazon.com

    часто, электрические профессионалы нужен быстрый способ проверить провод и провести измерение, не находя соединения или выхода. Параметр Field Sense мультиметра Fluke T6-1000 PRO Electrical Tester не только определяет напряжение, но и измеряет его без отключения соединений для проверки розетки.Просто наденьте тестовую вилку на провод, и T6-1000 сообщит о состоянии этого провода.

    T6-1000 имеет все остальные стандартные настройки, которые вы ожидаете от мультиметра, включая измерения постоянного и переменного тока, силы тока и сопротивления. Он поставляется с зажимами типа «крокодил», сменными тестовыми проводами и чехлом, чтобы держать его под рукой.

    Pros

    • Несколько настроек и показаний
    • Чтение значений переменного и постоянного тока
    • Также измеряет сопротивление и частоту

    Минусы

    com

    Для электрических работ с оборудованием, которое немного нагревается, таким как котлы, печи или промышленное оборудование, тестер напряжения NCVT-4IR от Klein Tools является разумным выбором. Помимо определения напряжения в диапазоне от 12 до 1000 вольт, эта модель оснащена встроенным инфракрасным термометром. Термометр может определять температуру от -22 до 482 градусов по Фаренгейту, обеспечивая безопасную проверку температуры без помощи рук.

    Тестер пера оснащен двухцветной светодиодной системой: белый означает, что он работает, и красный, когда он обнаруживает напряжение.Инфракрасный термометр имеет встроенную лазерную указку, которая упрощает достижение точных измерений. Обе функции работают от двух батареек AAA, и есть встроенное отключение для продления срока их службы.

    Pro Prov

    • и инфракрасный термометр
    • встроенный лазерный указл для измерений
    • Автоматическое отключение для сохранения срок службы батареи

    минус

    • Пластиковый клип, склонный к разбиванию

    Фото: Amazon.com

    В то время как большинство тестеров пера крепятся к карману брюк или помещаются в карман рубашки, некоторые из них слишком велики, чтобы удобно помещаться в этих карманах. Это не относится к карманному детектору напряжения FLK2AC от Fluke. Этот тестер пера имеет размеры всего 5¾ дюймов в длину и ¾ дюйма в толщину, что позволяет ему легко помещаться в кармане. Он также весит всего 10,6 унций, а это означает, что его не будет неудобно пристегивать к рубашке.

    FLK2AC обнаруживает напряжение от 90 до 1000 вольт, загорается красным и издает звуковой сигнал, указывающий на обнаружение напряжения.Он работает от двух батареек AAA и имеет функцию автоматического отключения, чтобы избежать случайного разряда батарей.

    плюсы

  • компактный блок
    • Compact Unit
    • Длительное время автономной работы
    • Точные показания
    • Точные показания

    минус

    Наш вердикт Наш вердикт

    Наш вердикт

    . Отличный общий тестер напряжения, который следует рассмотреть. имеет компактный дизайн и прост в использовании. Для покупателей, ищущих дополнительную универсальность, возьмите тестер напряжения Klein Tools и наслаждайтесь несколькими инструментами в одном устройстве.

    Как мы выбирали лучшие тестеры напряжения

    Лучшие тестеры напряжения достаточно малы, чтобы их можно было легко носить с собой, они обеспечивали точные показания и надежно и четко сообщали пользователям о наличии напряжения. Наш список рекомендаций предлагает покупателям несколько вариантов выбора, которые варьируются по цене и дополнительным функциям в соответствии с рядом требований — от бюджетных вариантов до профессиональных инструментов, способных измерять температуру, частоту, напряжение и сопротивление.

    Мы позаботились о том, чтобы включить в наш список лучших только легкие и компактные устройства, поскольку мы знаем, что такие рутинные испытания не должны включать громоздкое оборудование. Перечисленные выше продукты легкие и компактные для удобства, они отличаются длительным временем автономной работы и интуитивно понятным дизайном, чтобы пользователи были в безопасности и знали, что их тестер напряжения работает правильно.

    Часто задаваемые вопросы

    Тем, у кого все еще есть вопросы о выборе или использовании лучшего тестера напряжения, следует рассмотреть ответы на некоторые из наиболее часто задаваемых вопросов об этих основных инструментах.Здесь вы найдете более важную информацию, чтобы сделать осознанную покупку.

    В. Тестер напряжения — это то же самое, что и мультиметр?

    Нет, тестеры напряжения и мультиметры — это не одно и то же, хотя некоторые мультиметры оснащены тестером напряжения. Тестеры напряжения показывают только наличие напряжения. Мультиметры могут измерять величину напряжения, силы тока или сопротивления в приспособлении или цепи.

    В. Безопасны ли тестеры напряжения?

    Да, тестеры напряжения — это средства безопасности, и их можно безопасно использовать.Они имеют изоляцию для защиты от передачи тока, поэтому тестер не может передавать электричество на ваше тело.

    В. Как узнать, работает ли тестер?

    Большинство тестеров напряжения оснащены индикаторами заряда батареи, которые автоматически предупреждают вас о том, что тестер работает. Другие могут потребовать, чтобы вы активировали тест батареи. Если вы не уверены, проверьте работающую розетку, чтобы убедиться, что тестер работает.

    Martindale VIPD150-S 1000 В CAT IV Комплект индикатора напряжения и пруферента

    Martindale VIPD150-S 1000 В CAT IV Комплект индикатора напряжения и пруферента

    Магазин не будет работать корректно в случае, если куки отключены.

    Похоже, в вашем браузере отключен JavaScript. Для максимально удобного использования нашего сайта обязательно включите Javascript в своем браузере.

    Описание

    Нет ничего опаснее, чем полагаться на неисправный индикатор напряжения для проверки обесточенной цепи. Безопасные электромонтажные работы требуют использования индикатора напряжения, проверенного с помощью контрольного устройства до и после использования.

    Устройство Martindale VIPD150 содержит индикатор напряжения VI-15000 и проверочное устройство PD690, что позволяет выполнять рекомендации по охране труда и технике безопасности для безопасной работы.

    Новый VI15000 имеет рейтинг безопасности 1000 В CATIV и светодиодную индикацию для напряжения переменного/постоянного тока от 50 В до 690 В и выше, обеспечивая соответствие рекомендациям по охране труда и технике безопасности для безопасной работы во всех категориях установки BS EN61010. Это самый простой и надежный способ убедиться, что цепи обесточены и надлежащим образом изолированы перед техническим обслуживанием и модификациями. Основанная на одобренном промышленностью VI3800, новая конструкция CATIV не только обеспечивает улучшенную защиту от скачков напряжения, но также включает резистор высокой мощности, который ограничивает ток в случае повреждения кабеля в соответствии со стандартом BS EN61243-3.Защита встроена там, где это необходимо, в сборке ручного датчика, а не только в приборе, обеспечивая превосходную защиту пользователя от других тестеров.

    MTL15 поставляется с шестью сменными измерительными щупами для безопасного и простого измерения во всех областях применения, особенно в условиях ограниченного доступа. В дополнение к стандартным 62-мм прямому и прямоугольному зондам в комплект входят удлиненные 130-мм зонды. Для максимального удобства использования прямоугольные датчики можно поворачивать на 90, 180 и 270 градусов и фиксировать в нужном положении.

    Сверхпрочный кабель с двойной изоляцией, большой защитный кожух для пальцев и выдвижной запираемый чехол для зонда делают этот инструмент самым безопасным, прочным и надежным в своем роде. Новый дизайн соответствует требованиям последней редакции GS38, Edition 4 2015.

    Проверочное устройство PD690 вырабатывает 700 В переменного/постоянного тока для проверки индикаторов напряжения и других устройств с диапазонами до 700 В. Это портативный испытательный блок с батарейным питанием, который может работать от сети 12 В через автомобиль или от сети.Комплект поставляется с комбинированным футляром для переноски продуктов VI и PD, чтобы пруферент всегда был под рукой. Для удобства и экономии времени блок пруфера можно использовать, не вынимая его из футляра.

    Основные характеристики

    :

    • Индикатор напряжения переменного/постоянного тока, блок расстойки и комбинированный кейс для переноски
    • Расширенный диапазон напряжения до 1000 В с яркой светодиодной индикацией
    • Категория безопасности CAT IV 1000 В
    • Соответствует GS38 и BS EN61243-3:2010
    • Включает проверочное устройство 700 В
    • Соответствует требованиям по охране труда и технике безопасности для безопасной работы
    Технические характеристики
    Полный комплект из 3 предметов включает:
    PD690 Проверочное устройство:
    VI-15000 Индикатор напряжения:
    TC69 Мягкий футляр для переноски TC69:
    Подробнее
    Дополнительная информация
    Артикул MARVIPD150-S
    Марка Martindale
    Размер упаковки 1

    Оптимизация Стратегии разработки генетически закодированных индикаторов напряжения

    Abstract

    Генетически закодированные оптические индикаторы активности нейронов позволяют однозначно регистрировать паттерны входной-выходной активности идентифицированных клеток в интактных цепях.Среди них генетически кодируемые индикаторы напряжения (GEVI) предлагают дополнительные преимущества по сравнению с индикаторами кальция, поскольку они являются прямыми датчиками мембранного потенциала и могут точно сообщать о подпороговых событиях и гиперполяризации. Здесь мы описываем основные конструкции GEVI и даем отчет о свойствах, которые необходимо тщательно оптимизировать при разработке индикаторов. При разработке идеального GEVI следует учитывать такие аспекты, как локализация мембраны, размер сигнала, отношение сигнал/шум, кинетика и зависимость оптических откликов от напряжения.Используя ArcLight и его производные в качестве прототипов, мы определяем, как зонд должен быть оптимизирован для прежних свойств и разработан в соответствии с потребностями в других областях. Наконец, мы представляем обзор инженерного процесса GEVI и рассказываем об их открытии, доставке и диагностике.

    Ключевые слова: генетически закодированные индикаторы напряжения, ArcLight, Ci VSD, чувствительность к напряжению, мембранный потенциал

    Введение

    сома и далее к нервным окончаниям.Реальная проблема, однако, состоит в том, чтобы расшифровать обработку информации в каждом нейроне в контексте его соседей или, другими словами, неповрежденных нейронных цепей, потому что нейронные взаимодействия составляют основу чувственного восприятия, поведения и сознания.

    У млекопитающих нейронные ансамбли, состоящие из тысяч нейронов, часто участвуют в сложных процессах, таких как реконструкция визуальной сцены или маневрирование в локальной среде. Чтобы расшифровать обработку информации во время такого поведения, становится необходимым получить одновременные электрические записи паттернов активности ввода-вывода от всех участвующих нейронов с разрешением одной клетки.

    Традиционная электрофизиология основана на использовании накладных электродов (внутриклеточных) и многоэлектродных матриц (МЭА) (внеклеточных) для измерения электрических событий, сопровождающих обработку нейронных сигналов. Накладные электроды могут измерять как подпороговые синаптические потенциалы, так и потенциалы действия (ПД), но могут одновременно регистрировать только несколько нейронов. MEA, с другой стороны, состоят из сотен электрических контактов и могут использоваться для одновременного получения записей напряжения от нескольких сотен нейронов.Современные внеклеточные зонды могут обеспечить почти тысячу плотно расположенных отдельных участков записи, обеспечивая высокое пространственное разрешение для электрических измерений (Jun et al., 2017). Однако синтаксический анализ сигналов от отдельных нейронов не является простым, поскольку большинство сайтов берут сигналы от нескольких нейронов. Кроме того, этот метод не позволяет проводить целевые записи в определенных клетках, типах клеток или субклеточных компартментах (Buzsaki, 2004; Spira and Hai, 2013).

    Ограничения методов на основе электродов в значительной степени были смягчены оптическими подходами к мониторингу активности нейронов, такими как использование синтетических красителей и генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов.Используя последний, теперь можно одновременно однозначно регистрировать до 500 нейронов в трехмерном пространстве у бодрствующих и ведущих себя животных, сохраняя при этом клеточное разрешение с помощью методов многофотонного лазерного сканирования (Huber et al., 2012; Katona et al. ., 2012). Генетически кодируемые индикаторы могут быть сконструированы для избирательного нацеливания на определенные типы клеток и субклеточные компартменты, и делать это на определенных стадиях развития. Генетически кодируемые индикаторы кальция и вольтажа [GECI и генетически кодируемые индикаторы вольтажа (GEVI) соответственно] позволяют проводить продольную визуализацию активности меченых нейронов (Denk et al., 1996; Майнен и др., 1999; Мао и др., 2008 г.; Тиан и др., 2009 г.; Миттманн и др., 2011; Чен и др., 2012; Ваховяк и др., 2013 г.; Дана и др., 2014; Ротермель и Ваховяк, 2014 г.; Чжу и др., 2014; Lur et al., 2016), и являются методом выбора для функциональной визуализации субклеточных компартментов, например, дендритных шипов, недоступных для электродов, и организмов, менее подходящих для экспериментов с заплатой и зажимом, таких как Drosophila и Caenorhabditis elegans . (Тиан и др., 2009; Акербум и др.., 2012; Йошихара, 2012 г.; Ковачевич и др., 2013).

    Сравнение генетически кодируемых датчиков кальция и напряжения

    С момента их разработки в конце 1990-х годов чувствительность и кинетика индикаторов флуоресцентной активности значительно улучшились (Miyawaki et al., 1997; Romoser et al., 1997; Gong et al. , 2015; Chamberland et al., 2017; Kannan et al., 2018; Piatkevich et al., 2018), и начинают дополнять исследования на основе электродов для понимания фундаментальных аспектов нейрофизиологии.

    Индикаторы кальция представляют собой молекулярные слияния сенсора кальция, такого как кальмодулин или тропонин С, и флуоресцентного репортерного белка (FP). GECI представляют собой цитозольные белки, которые при связывании внутриклеточного Ca 2+ претерпевают конформационные изменения, которые модулируют выход флуоресценции FP. В некоторых случаях конформационные изменения в кальций-связывающем домене вместо этого модулируют резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) между парой донорных и акцепторных флуорофоров.Современные GECI включают GCaMP и RCaMP, GECO и Cameleons (Nagai et al., 2004; Palmer et al., 2006; Tian et al., 2009; Zhao et al., 2011; Akerboom et al., 2013; Chen et al. др., 2013). Поскольку они обнаруживают внутриклеточный Ca 2+ , уровни которого колеблются во время AP, GECI обеспечивают косвенную меру надпороговой активности нейронов.

    Напротив, GEVI представляют собой флуоресцентные трансмембранные белки, которые могут непосредственно ощущать колебания напряжения на мембране во время активности и синаптической передачи.Домен, чувствительный к напряжению (VSD) в GEVI, может быть получен из трансмембранных белков, таких как ионные каналы, чувствительные к напряжению фосфатазы или микробные опсины, и слит с одним FP или парой FRET-FP (Jin et al., 2012; Gong et al., 2013, 2014; Flytzanis et al., 2014; Hochbaum et al., 2014; St-Pierre et al., 2014; Zou et al., 2014; Piao et al., 2015; Abdelfattah et al. , 2016). Зонды на основе опсина также могут функционировать как автономные GEVI, которые сообщают об активности благодаря своей природной, хотя и слабой флуоресценции (Gong et al., 2013; Флитцанис и др., 2014; Хохбаум и др., 2014).

    Генетически кодируемые индикаторы напряжения проявляют зависящее от напряжения изменение флуоресценции посредством одного из двух различных механизмов: (1) за счет изменения конформации в датчике напряжения или (2) за счет сопряжения с переходами активного состояния во время фотоцикла пигмента сетчатки, хромофора в потенциалчувствительных опсинах. GEVI, подпадающие под категорию 1 типа, включают ArcLight, VSFP, ASAP1/2, Bongwoori и FlicR1 (Dimitrov et al., 2007; Акеманн и др., 2012; Джин и др., 2012 г.; Сен-Пьер и др., 2014 г.; Пиао и др., 2015 г.; Abdelfattah et al., 2016), тогда как части категории 2 включают производные Archaerhodopsin (Arch), такие как индикаторы QuasArs, Archers, Archons и FRET-opsin, а именно QuasArmOrange2, MacQ-mCitrine, и Ace2N-mNeon, среди прочих (Flytzanis et al., 2014; Gong et al., 2014, 2015; Hochbaum et al., 2014; Zou et al., 2014; Piatkevich et al., 2018). Различные шаблоны GEVI показаны на .

    Карикатура, показывающая различные конструкции GEVI. (A) Большинство GEVI типа 1 состоят из молекулярного слияния изолированного ДМЖП, полученного из фосфатазы, чувствительной к потенциалу, и одной FP или пары FRET FP. В конструкциях FRET FP могут сливаться тандемно или с любым концом VSD. CFP, голубой флуоресцентный белок; YFP, желтый флуоресцентный белок. (B) GEVI типа 2 содержат автономные микробные опсины, которые имеют семь трансмембранных спиралей (Th2–TH7), или конструкции опсин-FRET, в которых опсин может быть слит с флуорофором.Микробные опсины обладают широким спектром поглощения (500–700 нм) и служат для «гашения» флуоресценции присоединенного флуорофора при колебаниях напряжения.

    Как датчики мембранного потенциала, GEVI не ограничиваются обнаружением ПД в отличие от индикаторов кальция, но также могут сообщать о гиперполяризации, подпороговой деполяризации, например, связанные с синаптической передачей, и устойчивые деполяризации, которые представляют собой преходящие активированные состояния. Кроме того, в то время как индикаторы кальция демонстрируют медленную кинетику (около 50–75 мс для быстрого GECI GCaMP6f) и могут различать пики только на частоте 20 Гц или ниже (Chen et al., 2013), GEVI могут обеспечить превосходное временное разрешение, способное обнаруживать всплески на частотах выше 100 Гц (Gong et al., 2015).

    Инновация генетически закодированного индикатора напряжения

    Из-за своей отличительной субклеточной локализации и механизма действия критерии для разработки индикаторов напряжения по своей сути отличаются от индикаторов кальция, что создает уникальные проблемы при их разработке, разработке и тестировании.

    Для индикаторов напряжения требуются надежные сигналы трафика для обеспечения адекватной и эксклюзивной мембранной экспрессии, что является предпосылкой для высокого отношения сигнал/шум (SNR) в оптических записях – отношение пика оптического отклика к стандартному отклонению базовой линии флуоресценции ( Ф 0 ).Точное субклеточное нацеливание особенно важно для индикаторов напряжения, потому что полезные сигналы напряжения возникают, но из ограниченной области клетки (мембраны) по сравнению с большим объемом цитоплазмы, доступным для обнаружения кальция.

    Точно так же особенно сложно повысить чувствительность индикаторов напряжения. Чувствительность зонда на единицу изменения напряжения выражается как доля изменения флуоресценции (Δ F ) по отношению к базовой флуоресценции. Индикаторы кальция проявляют большую чувствительность, поскольку медленная кинетика последовательных переходных процессов кальция допускает кумулятивное увеличение амплитуд флуоресцентного отклика.Переходные процессы кальция, вызванные всплеском, имеют короткое время нарастания, но длительное затухание. Быстрые последовательности ПД заставляют отдельные переходные процессы суммироваться или, другими словами, накладываться друг на друга (Smetters et al., 1999). Таким образом, во время высокочастотных всплесков ПД (> ~ 20 Гц) GECI связывают накопленный кальций в течение нескольких сотен миллисекунд, намного после того, как основные спайки затухают, что приводит к длительным ответам с большим Δ F / F 0 значений. Действительно, точная кинетика (скорость включения и выключения) и динамический диапазон чувствительности индикатора зависят от его эффективной концентрации, сродства связывания Ca 2+ и клеточных буферных свойств кальция.Тем не менее, варианты GCaMP демонстрируют относительные изменения флуоресценции до 500% для серии из 10 AP и 1000–1700% для 160 AP в культуре нейронов, тогда как на самом деле их значения Δ F / F 0 для одиночных AP составляют всего 10–30% (Tian et al., 2009; Chen et al., 2013). Их высокая чувствительность in vitro также делает кальциевые зонды благоприятными для экспериментов in vivo , где они обеспечивают высокое SNR на фоне фоновой флуоресценции и ослабления сигнала в толстой ткани.Потоки напряжения, с другой стороны, чрезвычайно быстрые — ПД нейрона длится менее нескольких миллисекунд. Таким образом, чувствительность GEVI измеряется как Δ F / F 0 для одной точки доступа. Современные GEVI обладают скромной чувствительностью 40–80% Δ F / F 0 в культивируемых клетках при деполяризации 100 мВ (амплитуда AP) (Jin et al., 2012; Hochbaum et al., 2014; Piao et al. и др., 2015; Ян и др., 2016; Пяткевич и др., 2018). Ответы дополнительно демпфируются in vivo из-за фоновой флуоресценции и светорассеяния.Чтобы увеличить размер сигнала, по крайней мере, на порядок, становится неизбежным начало разработки и тестирования высокой пропускной способности.

    Как прямые датчики мембранного потенциала, GEVI могут быть настроены так, чтобы быть чувствительными к гиперполяризации. Однако диапазон напряжения, в котором распространяется чувствительность пробника, может быть разным. Во многих случаях его можно сместить в сторону более негативных потенциалов путем проведения специфических мутаций в ДМЖП (Dimitrov et al., 2007; Baker et al., 2012; Piao et al., 2015). Полная оптимизация зависимости оптических характеристик от напряжения требует тщательного рассмотрения экспериментальных потребностей и соответствующей разработки датчика напряжения.

    В следующих разделах мы рассмотрим характеристики идеального GEVI и текущее состояние датчиков.

    Мембранная локализация

    Чтобы сообщать об изменениях потенциала клеточной мембраны, индикаторы напряжения должны находиться в плазматической мембране. Они используют механизм доставки секреторных белков клетки для транспортировки сюда (Lippincott-Schwartz et al., 2000). Секреторные белки, которые синтезируются и собираются в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), экспортируются в комплекс Гольджи, где подвергаются созреванию. В конечном итоге они упаковываются в везикулы пост-Гольджи и перемещаются по микротрубочкам — тонким цилиндрическим структурам, которые составляют каркас клетки. Иногда неправильно свернутые белки и белки, которые прочно связываются с шаперонами (помощниками сворачивания белков), могут быть захвачены в ER или комплекс Гольджи, что приводит к внутриклеточным агрегатам.Внося свой вклад в нечувствительную к напряжению фоновую флуоресценцию, эти агрегаты могут ослаблять SNR сигналов напряжения в оптических записях.

    GEVI 1-го типа первого поколения FlaSh и его производные Flare, VSFP1 и SPARC представляли собой тандемные слияния потенциалзависимых калиевых или натриевых каналов и одного FP или пары FRET-FP (Siegel and Isacoff, 1997; Sakai et al., 2001; Ataka and Pieribone, 2002; Baker et al., 2007). Эти GEVI проявляли интенсивную внутриклеточную агрегацию в культивируемых клетках эмбриональной почки человека (HEK) и нейронах гиппокампа с флуоресценцией менее 5% на плазматической мембране.Внутриклеточная флуоресценция часто имеет «паутинообразный» паттерн, классический фенотип, указывающий на задержку ER (Baker et al., 2007) (4). Вероятно, из-за их плохой локализации в мембране эти ранние зонды проявляли крайне низкую чувствительность к напряжению в нейронах как in vitro , так и in vivo .

    Конфокальные изображения экспрессии GEVI в диссоциированных нейронах гиппокампа. (A–C) GEVI SPARC, VSFP-1 и Flare на основе ионных каналов демонстрируют плохую локализацию в мембране и «паутинообразные» внутриклеточные агрегаты, что свидетельствует о задержке белка в ER. (D,E) Датчики напряжения на основе VSD Arclight и ASAP1 демонстрируют превосходную мембранную экспрессию, которая четко видна даже в субклеточных компартментах, таких как дендриты (вставки). Шкала баров = 10 мкм (Baker et al., 2007; Jin et al., 2012; St-Pierre et al., 2014).

    Чтобы решить проблему агрегации, которая, как считалось, возникает из-за неправильной укладки белков мультимерных или модульных каналов, неуклюжие ионные каналы GEVI первого поколения были заменены автономным мономерным VSD трансмембранной фосфатазы, выделенной из асцидия Ciona кишечная (сокр. Ci VSD) (Димитров и др., 2007) (). Ci VSD представляет собой четырехпроходный трансмембранный белок (спирали S1-S4 α), который может независимо функционировать как сенсор напряжения (Murata et al., 2005).

    Впоследствии ортологи других видов, таких как курица, рыбка данио, мышь, человек и лягушка, были клонированы вместо Ci VSD в качестве предполагаемых датчиков напряжения. Полученные в результате зонды демонстрируют различные характеристики: ДМЖП цыплят (сокр. Gg VSD) и рыбок данио (сокр. Dr VSD), оказывающие сильное влияние на кинетику GEVI (Baker et al., 2012; Han et al., 2013; St-Pierre et al., 2014).

    Большинство GEVI на базе ЧРП – VSFP2, VSFP-Butterfly, Mermaid, ArcLight, Bongwoori и FlicR1 – содержат Ci ЧРП в качестве датчика напряжения, сплавленного с зеленым или красным FP, или парой FRET-FP (Dimitrov et al., 2007; Tsutsui et al., 2008; Akemann et al., 2012; Jin et al., 2012; Piao et al., 2015; Abdelfattah et al., 2016). Когда пара FP или FRET слита с любым внутриклеточным концом VSD (S1 или S4), GEVI демонстрируют преобладающую локализацию в мембране в ненейрональных и гиппокампальных культурах.Мембранная локализация, по-видимому, нарушается, когда FP встраивается во внеклеточную петлю между доменами S3 и S4. Однако это не относится к аналогичной вставке FP в Gg VSD в быстродействующем датчике напряжения ASAP1 (St-Pierre et al., 2014).

    Индикаторы на основе опсина также пострадали от внутриклеточной агрегации в культивируемых нейронах и срезах мозга, что требует алгоритмов взвешивания пикселей для количественной оценки флуоресцентного ответа. Эти алгоритмы выборочно усредняют изменения флуоресценции по пикселям, которые являются информативными (мембранными), при этом уменьшая вклад нечувствительного к напряжению фона (Hochbaum et al., 2014).

    Помимо датчика напряжения, выбор FP в направленных на мембрану слитых белках также влияет на экспрессию в мембране. Красные FP, такие как dsRED, mCherry и mOrange из актинии грибной Discosoma (класс Anthozoa), имеют большую склонность к агрегации, тогда как FP, выделенные из медузы Aequorea victoria , такие как широко используемый зеленый флуоресцентный белок (GFP ) и его производные, как правило, обеспечивают лучший трафик (Arrenberg et al., 2009; Gong et al., 2014). Циклические пермутированные (cp) FP, в которых N- и C-концевые фрагменты транспонированы, чтобы сделать их более податливыми для регуляции посредством конформационных изменений, как правило, труднее сворачиваться, а зонды напряжения, включающие cpFP, имеют большую склонность к агрегации. Barnett et al., 2012; Abdelfattah et al., 2016).

    Было показано, что добавление сигналов пептидов экспорта ER (FCYENEV) и переноса через мембрану (KSRITSEGEYIPLDQIDINV) от калиевого канала внутреннего выпрямления K ir 2.1 к С-концу микробных опсинов уменьшает внутриклеточные агрегаты и улучшает экспрессию мембран у млекопитающих. клетки (Gradinaru et al., 2008, 2010). Соответственно, новые GEVI разрабатываются так, чтобы включать эти пептиды в качестве гибридных меток (Gong et al., 2014).

    Наконец, при гиперэкспрессии индикаторов напряжения важно тщательно оценить любые неблагоприятные воздействия на свойства мембраны. Поскольку GEVI вводят носители заряда в мембрану, их экспрессия, вероятно, влияет на емкость мембраны — меру заряда, хранящегося на мембране, — что, в свою очередь, может влиять на последующие физиологические процессы. Сообщается, что емкостные эффекты GEVI минимальны при обычно достигаемом уровне экспрессии.Тем не менее, важно тщательно определять свойства пассивных мембран и оценивать ширину ПД при разработке новых индикаторов (Jin et al., 2012; St-Pierre et al., 2014; Gong et al., 2015).

    Чувствительность

    Чувствительность оптических индикаторов является важным параметром функциональной визуализации. Как указывалось выше, при проектировании GEVI также сложнее всего улучшить.

    Необходимость высокой чувствительности по напряжению

    Размер оптического сигнала является важным фактором, определяющим характеристики пробника по следующим причинам.

    Во-первых, чувствительность зонда напрямую влияет на ОСШ оптических сигналов. Высокое отношение сигнал-шум необходимо для надежной интерпретации данных, включая идентификацию подпороговых событий и высокоточное обнаружение пиков. Во-вторых, высокая чувствительность в предварительных скринингах с культивируемыми клетками гарантирует, что оптический сигнал будет различим на толстых срезах мозга и в экспериментах in vivo , где реакции флуоресценции ослабляются за счет поглощения тканями, рассеяния, автофлуоресценции и флуоресценции вне фокуса. (см. раздел «Отношение сигнал/шум»).В-третьих, большие оптические сигналы позволяют избежать необходимости усреднения откликов по нескольким разверткам. Следовательно, они позволяют визуализировать в физиологических условиях, когда ответы могут варьироваться от испытания к испытанию. Зонд, дающий заметный сигнал в одиночных испытаниях, позволяет обнаруживать нестационарные события, такие как спонтанные ПД и всплески ПД.

    Повышение чувствительности GEVI к напряжению

    ArcLight был одним из первых описанных GEVI, демонстрирующих высокую чувствительность — его выход флуоресценции снижается на целых 40 % Δ F / F 0 во время шагов деполяризации 100 мВ в клетках НЕК, 5% в ответ на ПД в культивируемых нейронах и острых срезах мозга и 2% in vivo в обонятельной луковице мыши (Jin et al., 2012; Цао и др., 2013; Кунст и др., 2014; Кляйн и др., 2015; Сторас и др., 2015). Также были разработаны индикаторы ASAP и Arch, демонстрирующие большие амплитуды отклика (Янг и др., 2016; Чемберленд и др., 2017; Пяткевич и др., 2018).

    Ориентация на FP или VSD

    Родительский зонд ArcLight был сконструирован путем слияния pH-чувствительного варианта GFP, ecliptic pHluorin, с С-концом Ci VSD. Он показал предельную чувствительность -1,3% Δ F / F 0 на 100 мВ деполяризации в клетках НЕК.Впоследствии случайное открытие — непреднамеренная замена аланина аспарагиновой кислотой в положении 227 в β-стволе GFP (A227D) — привело к улучшенному варианту с Δ F / F 0 на -18%. на 100 мВ (Jin et al., 2012) ().

    Мутации в последовательности FP, а также изменения длины линкера Ci VSD-FP влияют на чувствительность ArcLight к напряжению. (A) Реакция флуоресценции на деполяризацию 100 мВ клеток НЕК, трансфицированных Ci VSD-ecliptic pHluorin или Ci VSD-ecliptic pHluorin A227D. (B) Ступенчатые ответы 100 мВ (среднее значение ± стандартная ошибка среднего) клеток НЕК, экспрессирующих варианты 227A или 227D каждого из Ci VSD-ecliptic pHluorin, Ci VSD-eGFP или Ci VSD-SEP. (C) Кристаллическая структура eGFP (PDB ID 1EMG) с выделением A227, а также шести наиболее непохожих остатков между SEP и eGFP. Указаны версии SEP. Обратите внимание, что все четыре критических остатка 147, 227, 202 и 204 находятся на одной и той же поверхности цилиндра флуорофора. (D) Флуоресцентные ответы (среднее значение ± стандартная ошибка среднего) вариантов Ci VSD-SEP, несущих мутации в указанных остатках в (C) .Эти мутации служат для замены аминокислот SEP соответствующими остатками, обнаруженными в eGFP. (E) Кривые чувствительности к рН SEP и мутантов SEP, содержащих остатки eGFP в указанных местах. (F) Средние амплитуды ответа на деполяризацию 100 мВ производных ArcLight с модифицированной длиной линкера. Группы, существенно отличающиеся от ArcLight S249, отмечены звездочками. Δ относится к датчикам, демонстрирующим плохую локализацию мембраны (Jin et al., 2012; Han et al., 2014).

    Замена эклиптического pHluorin в ArcLight на superecliptic pHluorin (SEP), который содержит мутации F64L и S65T из усиленного GFP (eGFP), уменьшает приобретенную чувствительность, но Δ F / F 0 можно восстановить, просто повторно введя 227Д ().Важно отметить, что замена аспарагиновой кислоты любой из 18 других аминокислот полностью или частично ослабляет оптический сигнал. Другая отрицательно заряженная аминокислота, глутаминовая кислота, содержащая дополнительный углерод, сохраняет лишь треть улучшенной чувствительности (-6% Δ F / F 0 на 100 мВ), что позволяет предположить, что как отрицательный заряд , так и уменьшенные стерические эффекты компактной боковой цепи аспарагиновой кислоты имеют решающее значение для реакции на напряжение (Jin et al., 2012).

    В дополнение к A227D, другие остатки, специфичные для SEP и/или эклиптического pHluorin, по-видимому, играют роль в чувствительности ArcLight к напряжению. Это связано с тем, что ArcLight на основе eGFP/A227D, который отличается от SEP девятью мутациями, не может генерировать сигнал напряжения.

    Исследования потери функции показывают, что на самом деле три мутации в β-стволе, уникальные для pHluorins – S147D, S202F и Q204T – необходимы для флуоресцентного отклика ArcLight, зависящего от напряжения. Внедрения этих мутаций вместе с A227D достаточно, чтобы сделать датчик ArcLight на основе eGFP таким же чувствительным, как датчик на основе SEP/227D (Han et al., 2014) ().

    Однако на сегодняшний день остается неясным, как эти аминокислоты преобразуют изменения напряжения в флуоресцентный сигнал. Были предложены некоторые вероятные механизмы, основанные на взаимодействии FP с мембраной, чувствительности к pH и олигомеризации.

    Двухфотонная поляризационная микроскопия клеток НЕК, трансфицированных ArcLight, позволяет предположить, что SEP/227D проявляет линейный дихроизм, что означает, что флуорофор, вероятно, ориентирован параллельно поверхности мембраны. Это наблюдение вместе с данными о кристаллической структуре GFP, которые показывают, что все четыре критических остатка имеют обращенные наружу боковые цепи и принадлежат к соседним β-цепям (одна и та же поверхность) ствола GFP, позволяют нам предположить, что зависящее от напряжения конформационное изменение в Ci VSD может перемещать FP ближе к мембране и модулировать силу взаимодействия между цилиндром и мембраной.Обратимые изменения силы этих взаимодействий, в свою очередь, могут влиять на окружение хромофора и его депротонированное (флуоресцентное) состояние.

    Кроме того, SEP демонстрирует изменения флуоресценции в зависимости от pH (). D147 служит внутренним датчиком pH, который сдвигает основание кривой чувствительности pH, приближая pKa GFP (pH при полумаксимальной флуоресценции) почти к нейтральному значению pH окружающей среды мембраны. Это также делает наклон кривой более крутым (>1). Наклон больше единицы предполагает, что даже незначительные изменения pH, которые можно было бы ожидать во время ПД, когда протоны мобилизуются электрическим полем, могут вызывать большие изменения флуоресценции.Остается неясным, действительно ли чувствительность ArcLight к напряжению связана с измерением pH SEP. Замена других FP с аналогичными кривыми pH, такими как логометрический pHluorin или YFP, не приводит к созданию чувствительных к напряжению вариантов даже в присутствии A227D. Возможно, что мутации, уникальные для SEP, имеют решающее значение для чувствительности ArcLight, и отсутствие этих мутаций может привести к быстрой буферизации небольших изменений pH. Тем не менее, чувствительность SEP к pH, по-видимому, не только модулирует отклики ArcLight, поскольку мутации в Ci VSD могут независимо настраивать его чувствительность к различным диапазонам напряжения (см. раздел «Зависимость оптических откликов от напряжения»).

    Наконец, олигомеризация FP также может влиять на чувствительность к напряжению. Установка тандемного SEP после Ci VSD значительно уменьшает размер отклика и меняет полярность оптического сигнала (+2% Δ F / F 0 на 100 мВ). Напротив, в индикаторе Pado, основанном на протонном канале SEP/227D, мутация предполагаемого сайта димеризации FP снижает его чувствительность, предполагая, что димеризация обычно стабилизирует оптический сигнал (Kang and Baker, 2016).Неясно, однако, существует ли SEP/227D в виде димеров в интактных GEVI, и если да, то почему димеризация имеет разные эффекты в разных каркасах.

    Для более точного выяснения механизма требуется электронная микроскопия и исследования рентгеновской кристаллизации для определения структуры интактного GEVI до и во время деполяризации. Однако мембранные белки довольно сложно кристаллизуются в нативном свернутом состоянии (Parker and Newstead, 2016).

    Аналогичным образом было показано, что множественные мутации в коре опсина, расположенном вблизи хромофора, приводят к значительному улучшению чувствительности к напряжению в индикаторах на основе Arch (Hochbaum et al., 2014; Пяткевич и др., 2018).

    Также было показано, что первичная последовательность преобразователя частоты регулирует чувствительность к напряжению. Недавно единственная мутация R415Q в спирали S4 Gg VSD в ASAP открыла новый вариант ASAP2s с поразительно высокой чувствительностью (-38% Δ F / F 0 на 100 мВ) к шагам деполяризующего напряжения. Ответ представляет собой улучшение на 66% по сравнению с родительским шаблоном ASAP1 (-23% Δ F / F 0, на 100 мВ) (Chamberland et al., 2017). Однако мутация повлияла на кинетику ответа, уменьшив время нарастания с 2,9 до 5,2 мс. Это наблюдение не совсем удивительно, учитывая, что предполагается, что движения спирали S4 участвуют в восприятии напряжения (см. раздел «Источник ДМЖП»).

    Вместе эти результаты указывают на важную роль первичной аминокислотной последовательности в регулировании характеристик напряжения индикатора.

    Ориентация на линкер

    Помимо VSD и FP, изменение длины и состава последовательности AA в линкере между двумя доменами часто приводило к значительному улучшению чувствительности к напряжению.

    Укорочение линкера между спиралью S4 Ci VSD и SEP/227D удвоило амплитуду отклика ArcLight (∼35–40% против 18% Δ F / F 0 на 100 мВ). Это было достигнуто за счет усечения линкера по одной аминокислоте от остатка S249 VSD и приближения SEP к S4 до тех пор, пока оптический отклик не достигал насыщения, т.е. между позициями S243 и Q239 ().

    Аналогичным образом замена и делеция с участием двух аминокислот (A147S ΔA148) в линкере между спиралью S3 и FP в ASAP1 увеличили его оптический сигнал до ~45% с 30% Δ F / F 0 на 50 мВ, хотя и для ответов на гиперполяризацию (Yang et al., 2016).

    Датчики передачи энергии флуоресцентного резонанса еще больше полагаются на оптимальную длину линкера (и состав AA), поскольку эффективность FRET обратно пропорциональна шестой степени расстояния между донорными и акцепторными FP. Например, GEVI QuasAr-mOrange2 типа 2 был получен путем постепенного укорочения линкера путем усечения не только С-конца датчика напряжения с гасителем FRET QuasAr, но и N-конца донора FRET mOrange2 с последующей рандомизацией. двух остатков на пересечении (Zou et al., 2014).

    Хотя уменьшение длины линкера в большинстве случаев повышает производительность, позволяя конформационным изменениям в VSD лучше проникать в FP, слишком близкое расположение двух мотивов друг к другу также может мешать их колебательной свободе и ослаблять чувствительность. Например, приближение FP к Q239 преобразователя частоты Ci снижает чувствительность ArcLight к напряжению. Более того, большие делеции в ДМЖП и/или FP могут неблагоприятно влиять на фолдинг и экспрессию белка (Han et al., 2014; Цзоу и др., 2014). Мы заметили, что нетрадиционные FP со структурой, отличной от классического ствола, как правило, требуют более длинных линкеров. Это может быть достигнуто путем введения одного или нескольких рандомизированных (NNK) кодонов в месте соединения и выбора инсерционных мутантов для повышения чувствительности к напряжению.

    Полярность оптического сигнала

    Большинство современных GEVI, за исключением семейства автономных опсинов Arch и FlicR1, демонстрируют уменьшение флуоресценции после деполяризации.Эти зонды с отрицательным наклоном зависимости напряжения от флуоресценции (кривые Δ V / Δ F ) ярче в состоянии покоя, чем во время AP. Их высокая базовая флуоресценция может быть невыгодной, поскольку флуорофоры склонны к фотообесцвечиванию даже при интенсивном окружающем освещении, а потеря флуоресценции (уменьшение количества фотонов) может отрицательно сказаться на SNR. Кроме того, флуоресценция не в фокусе от соседних покоящихся нейронов может увеличить уровень шума, еще больше ослабляя SNR, в широкопольных записях интактной ткани.Например, в исследовании обоняния in vivo у мух посторонняя флуоресценция ArcLight от некомпланарных клубочков искажала сигналы от областей интереса (ROI), включающих соответствующие клубочки на поверхности антенных долей. Плохое SNR приводило к пахучим реакциям, которые не соответствовали опубликованным внеклеточным записям периферических сенсилл. Проблема была частично преодолена за счет ограничения экспрессии ArcLight в определенных клубочках с помощью генетического нацеливания (Cao et al., 2013).

    Низкая базовая флуоресценция, напротив, хорошо коррелирует с высокими SNR, как в случае с наиболее продвинутыми вариантами GCaMP (Chen et al., 2013). GCaMPs реагируют на AP, увеличивая выход флуоресценции по сравнению с уровнями покоя.

    Недавняя работа нашей лаборатории демонстрирует, что определенные мутации FP могут изменять полярность оптического сигнала. Замена трех остатков в SEP ArcLight гидрофобными аминокислотами (D389A, h490A и Y442V) дает новый зонд с положительно наклоненной кривой Δ V / Δ F .В то время как 389A служит для изменения полярности, другие, также расположенные на той же поверхности β-цилиндра, увеличивают амплитуду отклика в том же направлении. Однако гидрофильные или полярные остатки в этих сайтах возвращают полярность к полярности ArcLight. Это открытие подтверждает аргумент о том, что чувствительные к напряжению движения в Ci VSD модулируют силу взаимодействия между FP и гидрофобной мембраной, и предполагает, что как чувствительность к напряжению, так и полярность оптических ответов могут быть изменены путем нацеливания на флуорофор (Platisa et al., 2017).

    Красный индикатор напряжения FlicR1 также показывает положительную реакцию на деполяризацию (Abdelfattah et al., 2016). FlicR1 состоит из Ci VSD, слитых с cp-mApple. Неясно, вызвано ли это изменение последовательностью и геометрией mApple, которые отличаются от семейства GFP, или его круговой перестановкой. Предыдущее исследование показало, что круговая перестановка может оказывать двунаправленное влияние на полярность, при этом некоторые каркасы на основе Ci VSD/cp-eGFP проявляют положительный, а другие отрицательный ответ на деполяризацию (Barnett et al., 2012).

    Значение размера сигнала для экспериментов
    in vivo

    Благодаря большому динамическому диапазону чувствительности индикаторы кальция идеально подходят для рутинной визуализации in vivo . Напротив, было продемонстрировано, что только несколько GEVI со значительной чувствительностью действуют in vivo на (Cao et al., 2013; Carandini et al., 2015; Gong et al., 2015; Storace et al., 2015; Yang et al., 2015). др., 2016). Низкая чувствительность особенно проблематична для широкопольной (однофотонной) микроскопии, где флуоресценция вне фокуса снижает SNR (Flusberg et al., 2008; Мукамель и др., 2009).

    Впервые получено изображение ArcLight in vivo у дрозофилы . Здесь зонд был генетически нацелен на специфические обонятельные сенсорные нейроны (OSN) путем управления экспрессией ArcLight с промоторов генов клеточно-специфических обонятельных рецепторов. Одорантную настройку пресинаптических OSN и их гломерулярных проекций изучали с помощью широкоугольной визуализации с помощью синего лазера (488 нм). Оптические сигналы собирались с частотой 125 Гц с помощью малошумящей камеры с зарядовой связью (ПЗС).Как и ожидалось из установленных электрических записей сенсилл, различные подтипы OSN, экспрессирующие ArcLight, демонстрировали возбуждающие ответы (до -5% Δ F / F 0 ) на выбор одорантов с высокой степенью одорантной настройки. Сигналы были различимы в однократных записях и сообщали об относительных различиях в силе реакции на разные одоранты и разные дозы. Например, клубочек DC2 продемонстрировал более сильную реакцию на 3-октанол, чем на 1-бутанол (-5% против -2% Δ F / F 0 ).Кроме того, ArcLight также выявил ингибирующие реакции в VA1v с аналогичной чувствительностью (Cao et al., 2013) ().

    ArcLight сообщает об ответных реакциях на одоранты в отдельных записях испытаний на Drosophila . (A) Схематическое изображение in vivo эксперимента по визуализации мочки усика Drosophila после презентации запаха. (B) Схематическая диаграмма билатеральных антенных долей, показывающая проекции OSN, экспрессирующих Or56a, Or13a или Or47b, на соответствующие клубочки. (C) Репрезентативные оптические записи активности мембран на пресинаптических окончаниях OSN после указанного применения запаха. Желтая рамка указывает время применения запаха. Цвета указывают на различные концентрации одоранта 10, 1 или 0,1% или записи, полученные из левого (L) или правого (R) клубочков. Шкала баров = 10 мкм (панели 2 и 4) и 20 мкм (панели 1 и 3) (Cao et al., 2013).

    ASAP2f, который был разработан для обеспечения высокой чувствительности и улучшенной кинетики, использовался для описания свойств зрительной реакции на лету с превосходной чувствительностью до -10% Δ F / F 0 в усредненных развертках .Данные, полученные с помощью двухфотонного микроскопа, обеспечили высокое пространственное разрешение для субклеточной визуализации (Yang et al., 2016).

    Аналогично, Ace2N-mNeon, высокоскоростной индикатор FRET-опсина, состоящий из опсина Acetabularia и mNeonGreen, может сообщать о свойствах настройки ориентации в редко помеченных нейронах зрительной коры мыши с амплитудой ответа -3% Δ F / F 0 на точку доступа. Зонд, который демонстрирует ∼-10% Δ F / F 0 на АР в культивируемых нейронах, обладает превосходной кинетикой, которая компенсирует кажущуюся низкую чувствительность и увеличивает скорость обнаружения спайков in vivo (Gong et al., 2015).

    Несмотря на то, что широкоугольная визуализация может снижать ОСШ, смешивая оптические сигналы с флуоресценцией вне фокуса, нацеливание зондов на определенные типы клеток может свести к минимуму неспецифическое мечение и улучшить качество изображения. Такие записи с низким уровнем шума способствуют изоляции отдельных ответов в одиночных испытаниях. Кроме того, они полезны для измерения активности в определенных типах клеток, недоступных для электродов, таких как циркадные нейроны дрозофилы (Cao et al., 2013).

    Оптические записи у мышей также облегчаются за счет направленной экспрессии индикаторов в генетически идентифицированных популяциях, за которыми следуют истонченные препараты черепа или имплантаты черепного окна, чтобы обеспечить визуализацию через неповрежденную ткань. Однако живая визуализация у мышей влечет за собой такие проблемы, как артефакты движения от дыхания и пульсации кровеносных сосудов, гемодинамические артефакты от поглощения света (λ < 650 нм) гемоглобином и зеленая автофлуоресценция от эндогенных хромофоров никотинамидадениндинуклеотида и флавопротеинов.Все вышеперечисленное может существенно загрязнить сигналы и может быть особенно проблематичным при использовании индикаторов с синим смещением. Некоторые из этих проблем могут быть решены путем разработки зондов с красным смещением, применения стратегий временной и пространственной фильтрации или логометрической визуализации с индикаторами FRET. Однако в долгосрочной перспективе повышение чувствительности и SNR является ключом к улучшению обнаружения событий in vivo. Действительно, после описания GCaMP3 в этой области наблюдался огромный всплеск использования GECI, который затем демонстрировал достаточно большой динамический диапазон чувствительности от ~10 до ~120% Δ F / F 0 для AP и вероятности обнаружения всплесков, которые коррелируют с размерами ответов (Tian et al., 2012).

    Отношение сигнал-шум

    Отношение сигнал-шум сигналов напряжения обеспечивает меру точности индикатора для обнаружения частоты (и синхронизации) отдельных пиков и подпороговых сигналов. Большой SNR позволяет обнаруживать события из отдельных испытаний, устраняя необходимость в усреднении. Отношение сигнал-шум оптических записей зависит от внутренних свойств индикатора, таких как яркость, квантовый выход и длины волн возбуждения/испускания, а также от внешних факторов, таких как экспрессия белка, перенос мембраны, интенсивность освещения, источники шума, эмиссионный фильтр, числовая апертура ( NA) объектива и выбора детектора.

    Выбор флуоресцентного белка

    Важным первым шагом в разработке зонда является выбор FP с высоким квантовым выходом флуоресценции (φ), яркостью, которая является произведением φ и коэффициента экстинкции (𝜀), и фотостабильностью. Такие FP, как eGFP, mNeonGreen, mCitrine и mRuby, имеют высокие значения φ (0,5–0,8) и яркости (60–90) и являются отличными зондами с высоким SNR (Jin et al., 2012; St-Pierre et al., 2014; Zou et al., 2014; Gong et al., 2015; Bajar et al., 2016). Напротив, производные Arch, которые работают как автономные GEVI, имеют флуоресценцию φ порядка от 10 -4 до 10 -3 .Хотя опсины все еще могут давать сигналы с высоким SNR при высокой интенсивности освещения (от 880 мВт мм -2 до 8 Вт мм -2 , в 18–80 раз больше, чем требуется для зондов на основе GFP) и в сочетании с чувствительным электронным умножением. -CCD или комплементарные металл-оксид-полупроводниковые (cMOS) детекторы (Flytzanis et al., 2014; Hochbaum et al., 2014), они непрактичны для изучения интактных тканей, поскольку высокая интенсивность света может вызвать нагрев образца, фотоповреждение и автофлуоресценцию ткани. С тех пор они были адаптированы в зонды опсин-FRET, где они сливаются со стандартными флуорофорами, чтобы улучшить обнаружение в стандартных условиях.

    Фотостабильность, определяемая как время фотообесцвечивания до полуфлуоресценции при постоянном освещении, является еще одним фактором, ухудшающим SNR, особенно во время длительных сеансов записи. Фотостабильные зонды демонстрируют обесцвечивание от низкого до умеренного во время эксперимента и не требуют обширной коррекции обесцвечивания для изоляции сигналов. Индикаторы на основе GFP имеют тенденцию к фотообесцвечиванию быстрее, чем опсины, ограничение, связанное со свойствами доступных в настоящее время флуорофоров.

    Спектральные свойства FP также влияют на SNR для изображений in vivo.Оптические сигналы, особенно от зондов с синим смещением (λ < 650 нм), склонны к затуханию из-за поглощения и рассеяния в мозге и демонстрируют низкий контраст на фоне аутофлуоресценции зеленой ткани. Зонды с красным смещением менее подвержены потерям из-за поглощения или рассеяния, а коэффициент затухания при 600–700 нм составляет примерно половину от коэффициента затухания при 500 нм. В результате их оптическое пропускание (проникновение в ткани) почти вдвое выше (Flock et al., 1992; Al-Juboori et al., 2013).

    Однако следует иметь в виду, что оптические и спектральные свойства FP могут быть неприменимы к сконструированному GEVI, поскольку слияние FP с VSD и мутация его первичной последовательности могут влиять на укладку белка и окружение хромофора, существенно изменяя нативный флуорофор. .

    Probe Expression

    Эксклюзивная экспрессия GEVI в плазматической мембране важна для минимизации загрязнения полезных сигналов внутриклеточной флуоресценцией, устойчивой к изменениям напряжения. В некоторой степени это может быть достигнуто путем встраивания сигналов переноса через мембрану в кодирующую последовательность или кооптации pH-чувствительных флуорофоров, таких как эклиптический pHluorin и SEP, флуоресценция которых «затмевается» в кислых внутриклеточных компартментах. Кроме того, адекватная экспрессия трансгена требует использования соответствующих векторов для доставки генов, таких как рекомбинантные аденоассоциированные вирусы (rAAV) или плазмидная ДНК для электропорации in utero .

    Также важно добиться разреженной экспрессии индикаторов в отдельных нейронах, чтобы уменьшить фоновую флуоресценцию из-за ослабления ОСШ. Для некоторых типов нейронов, таких как кортикальные пирамидные клетки и интернейроны, специфичная для слоя экспрессия может быть достигнута путем доставки плазмидной ДНК к эмбрионам, вынашиваемым мышами, беременными по времени, с помощью электропорации in utero (Wang and Mei, 2013; De Marco Garcia and Фишелл, 2014). Определенные подтипы нейронов также могут быть нацелены на использование различий в профилях экспрессии их генов.Используя промоторы, специфичные для клеточного типа, вместе с комбинаторными стратегиями нацеливания на гены, такими как Cre recombinase/loxP или системы трансактивации тетрациклина (tTA), можно как пространственно, так и временно регулировать экспрессию индикатора.

    Оптические приборы

    Как и в любой флуоресцентной микроскопии, отношение сигнал-шум в функциональной визуализации также зависит от оптической установки.

    Объективы с высокой числовой апертурой (ЧА) (∼1,2) могут передавать больше фотонов возбуждения и собирать больше флуоресцентных фотонов, тем самым повышая яркость сигнала и разрешение [разрешаемое расстояние R = λ/ (2 × ЧА )] (Поршень, 1998).В сочетании с детекторами высокого разрешения они позволяют лучше идентифицировать области интереса. Интенсивность освещения должна быть адекватной для преодоления ограничений по дробовому шуму из-за стохастических флуктуаций количества фотонов. Тем не менее, интенсивность света не должна быть чрезмерной, поскольку она может ускорить фотообесцвечивание, вызвать нагрев образца и фототоксичность. Точно так же следует тщательно выбирать эмиссионные фильтры, чтобы свести к минимуму загрязнение флуоресценции возбуждающим светом, который может резко затенить сигналы.ФП с большим стоксовым сдвигом — разницей между максимумами поглощения и излучения — полезны для избежания спектрального перекрытия (Пяткевич и др., 2010, 2013; Чу и др., 2016).

    Выбор детектора — еще один фактор, влияющий на SNR. ПЗС-камеры, предлагаемые Redshirt Imaging, LLC, особенно подходят для высокоскоростной визуализации с частотой до 2 кГц или 5 кГц с биннингом 3 × 3 пикселя и позволяют обнаруживать оптические отклики на точки доступа. Учитывая их высокую квантовую эффективность (> 80%) — показатель процента обнаруженных фотонов — и низкий уровень шума считывания, эти камеры обеспечивают SNR, близкое к теоретическому максимуму.

    Хотя обычная однофотонная микроскопия обеспечивает высокую скорость сбора данных, поскольку фотоны отбираются параллельно, двухфотонное лазерное сканирование является лучшим вариантом для визуализации in vivo , поскольку оно обеспечивает превосходное отношение сигнал-шум благодаря трехмерному оптическому секционированию и улучшенному пространственному разрешению. . Индикаторы на основе ДМПП типа 1, такие как ArcLight и ASAP2f, успешно использовались для визуализации медленной динамики внутриклеточного напряжения in vivo (Cao et al., 2013; Storace et al., 2015; Ян и др., 2016). Например, ArcLight сообщает об одорантных реакциях в популяциях обонятельных клубочков с чувствительностью примерно от -1 до -2% Δ F / F 0 при однократной регистрации проб при двухфотонной микроскопии, а также при широкопольной визуализации (Storace et al. др., 2015). Однако большое время задержки пикселей современных лазеров и низкая частота кадров (10–100 Гц) не позволяют использовать их для визуализации реакции на быстрые колебания напряжения, а именно. AP (длительность <1–2 мс). Чтобы преодолеть эту проблему, недавно было продемонстрировано, что сканирование с произвольным доступом, которое обеспечивает высокую скорость сбора данных до 1 кГц, хорошо работает с новым вариантом ASAP ASAP2.Тем не менее, в то время как высокая чувствительность ASAP2 (-15% Δ F / F на точку доступа в условиях широкопольного изображения) была воспроизведена при двухфотонной микроскопии, зонд более сильно пострадал от фотообесцвечивания во время лазерного сканирования по сравнению с однофотонным визуализации (Chamberland et al., 2017).

    Неясно, оптимизированы ли GEVI на основе опсина для двухфотонной визуализации. Недавние исследования показали, что опсиновые GEVI, такие как индикаторы на основе Arch, Ace-mNeon и MacQ-mCitrine, плохо работают под лазерной сканирующей микроскопией.Преобладающая гипотеза состоит в том, что фемтосекундный импульсный лазер, вероятно, мешает фотоциклу родопсина, а опсиновые GEVI могут не удерживаться в своем чувствительном к напряжению состоянии во время «темновой» фазы (Brinks et al., 2015; Chamberland et al., 2017).

    В качестве альтернативного метода визуализации недавно было показано, что мощная волоконно-оптическая техника позволяет регистрировать динамику трансмембранного напряжения для конкретных типов клеток с использованием индикаторов опсин-FRET. Метод записи 0-D, называемый трансмембранными электрическими измерениями, выполняемыми оптическим способом или TEMPO, позволяет активировать флуоресценцию лазерными лучами, доставляемыми по оптическим волокнам, и регистрировать сигнал с помощью фотоприемников, соединенных с блокирующими усилителями.Этот метод предлагает чувствительность, приближающуюся к теоретическим пределам, налагаемым фотонным шумом (Marshall et al., 2016).

    В принципе можно использовать высокоскоростную эпифлуоресцентную визуализацию для регистрации пиков in vivo , но данные потребуют серьезной постобработки, чтобы отличить отклики напряжения от фоновой флуоресценции. Кроме того, изображения по-прежнему будут давать мало пространственной информации, которую можно вывести только из обработанных сигналов. В исследовании, описывающем Ace2N-mNeon, оптические ответы на спонтанное срабатывание in vivo были зафиксированы с использованием широкоугольной визуализации со скоростью сбора данных до 2 кГц.Нейроны локализовали по электрической активности околоклеточного электрода. Изображения были подвергнуты вычитанию фона, а отклики напряжения были выборочно извлечены из пикселей, которые демонстрировали верхние 20% значений SNR, которые в основном соответствовали интересующим соматам (Gong et al., 2015).

    Кинетика отклика

    Улучшение скорости индикаторов напряжения для отслеживания отдельных точек доступа и определения быстрых серий всплесков может максимизировать их полезность в исследованиях в области неврологии.Однако, как упоминалось выше, достижения в области методов визуализации должны дополнять разработку GEVI, направленную на улучшение кинетики ответа.

    В ArcLight и других GEVI на основе частотно-регулируемого привода кинетика в значительной степени контролируется движениями частотно-регулируемого привода, чувствительными к напряжению. В ответ на флуктуации напряжения в ДМЖП проявляются «запирающие» движения заряда, которые, как часть нативных ионных каналов и чувствительных к напряжению фосфатаз, облегчают запирание каналов или активацию ферментов. Структурные исследования показывают, что активация напряжения Ci VSD заставляет спираль S4 скользить вверх примерно на 5 Å вдоль своей главной оси и поворачиваться примерно на 60°, чтобы мобилизовать предполагаемые заряды управления — серию равномерно расположенных аргининов (рис. Маннуццу и др., 1996; Ян и др., 1996; Ли и др., 2014) (). Предполагается, что это конформационное изменение пронизывает FP индикаторов напряжения, тем самым модулируя выход их флуоресценции.

    Генетически кодируемые вольтаж-индикаторы Кинетика и вольтаж-зависимость оптических ответов во многом зависят от вольтаж-чувствительных конформационных изменений в его ДМЖП. (A) Кристаллическая структура VSD Ciona enteralis , чувствительной к напряжению фосфатазы (PDB ID 4G7V). Показаны четыре трансмембранные спирали S1-S4.S4 выделен красным. Положение управляющих аргининов R1–R4 (каждая третья аминокислота, начиная с 223), а также самого внешнего аргинина S4 R0 (положение 217 в Ci VSD) показаны синим цветом. Противозаряды D1 (на спирали S2), D2 и E3 (на спирали S3) обозначены красным. (B) Механическая модель измерения напряжения в Ci VSD. Активированное состояние UP сопровождается движением вниз на 5 Å S4 и вращением всей спирали на ~60° против часовой стрелки. Затем аргинины стабилизируются последовательными отрицательными зарядами от пар R1-D1, R2-D2 и R3-D3 в состоянии покоя или DOWN до R2-D1, R3-D2 и R4-E3 в конфигурации UP. (C) Выравнивание последовательностей трансмембранных сегментов VSD ортологов чувствительных к напряжению фосфатаз. Положительные, отрицательные и полярные остатки обозначены красным, синим и фиолетовым соответственно. Нумерация соответствует гомологу Ciona (Li et al., 2014; Piao et al., 2015).

    Напротив, чувствительность индикаторов на основе опсина к напряжению зависит не от движений сенсора, а от изменений в протонированном состоянии хромофора сетчатки.Считается, что эти изменения происходят почти мгновенно во время переходных процессов напряжения, и в результате большинство автономных опсинов и опсин-FRET GEVI демонстрируют ускоренную кинетику в субмиллисекундных временных масштабах.

    Источник VSD

    Быстрая кинетика впервые наблюдалась в индикаторе напряжения на основе ионных каналов SPARC. SPARC состоит из скелетного натриевого канала крысы rNav1.4, слитого с eGFP, который встроен во внутриклеточную петлю между его вторым и третьим доменами. Быстрая кинетика флуоресцентного отклика (экспоненциальное время нарастания τ-вкл <1 мс; <0.5% Δ F / F 0 на 100 мВ) отражает быстрые зависящие от напряжения движения стробирующих зарядов, вероятно, в трансмембранных доменах I и II (Ataka and Pieribone, 2002).

    Большинство датчиков Ci на основе преобразователей частоты имеют медленное время нарастания, составляющее десятки миллисекунд, и более медленное затухание, составляющее около 80–100 мс (Dimitrov et al., 2007; Tsutsui et al., 2008; Perron et al., 2009; Jin и др., 2012). ArcLight-Q239, вариант с самым коротким линкером и максимальной чувствительностью, демонстрирует двойную экспоненциальную кинетику со временем включения 9 (τ1) и 48 (τ2) мс и временем выключения 17 (τ1) и 60 (τ2) мс ( на 100 мВ).Быстрые составляющие (τ1s) во время нарастания и спада составляют 50 и 80% от полной амплитуды соответственно.

    Было показано несколько подходов к изменению кинетики зондов на основе VSD. Один из них заключался в простой замене Ci VSD на ортологи. Замена Dr на VSD или Gg на VSD, например, создает варианты ArcLight с более быстрой и простой кинетикой (одной экспоненциальной) с постоянными времени τ-on и τ-off ∼5 и ∼9 мс соответственно. Эти варианты, однако, демонстрируют пониженную чувствительность по сравнению с вариантом Ci VSD, предположительно из-за измененных взаимодействий между ортологами VSD и SEP 227D.Тем не менее, Куриный ArcLight может обнаруживать ПД в культивируемых нейронах в одиночных испытаниях с чувствительностью ∼-3% Δ F / F 0 и разрешать смоделированные ПД на частоте 100 Гц в клетках HEK (Han et al., 2013). ).

    VSD рыбок данио и цыплят аналогичным образом повышают кинетику реакции как часть других каркасов GEVI. Например, Zahra, гибрид Dr VSD и пары CFP/YFP FRET, демонстрирует константы времени ~3,5–5 мс на деполяризацию 100 мВ, что является значительным улучшением по сравнению с его предшественником Ci на основе VSD VSFP2.1 (Димитров и др., 2007; Бейкер и др., 2012). Точно так же другой датчик на основе FRET, Mermaid, демонстрирует улучшенную кинетику по сравнению с Gg VSD-ArcLight, когда Ci VSD заменен ортологом из курицы (Tsutsui et al., 2008; Han et al., 2013). Gg VSD также придает превосходную кинетику ASAP1/2, в которой cp-superfolder GFP встроен во внеклеточную петлю S3-S4. Хотя ASAP1/2 демонстрирует двойную экспоненциальную кинетику, в ответах преобладают быстрые компоненты (τ1 = 2 мс) (St-Pierre et al., 2014).

    Напротив, VSD лягушки и человека ухудшают кинетику ArcLight, генерируя ответы медленнее, чем версия Ciona (τ-вкл. = 11 и 70 мс, τ-выкл. = 155 и 70 мс соответственно) (). Интересно, почему разные ортологи VSD демонстрируют различную кинетику. Частично расхождения, по-видимому, связаны с изменениями в их первичной последовательности, которые могут влиять на скорость движения стробирующих зарядов.

    Изменение вида VSD или циклическая перестановка FP усиливает кинетику GEVI (A) τ-включение и τ-выключение оптических ответов на деполяризацию 100 мВ в клетках НЕК, трансфицированных производными ArcLight на основе напряжения лягушки, курицы, рыбки данио или человека чувствительный ортолог фосфатазы. (B) Вверху слева: конфокальное изображение культивируемых нейронов гиппокампа, экспрессирующих ArcLight курицы. Масштабная линейка = 20 мкм. Внизу слева: изображение нейрона, сделанное быстрой ПЗС-камерой 80 × 80, из которого были получены электрические и оптические записи на правой панели. ROI имеют цветовую кодировку, соответствующую цветам соответствующих оптических кривых. Справа: отдельные пробные записи вызванных ПД с использованием курицы ArcLight. Соматические записи и записи нейритов подвергались низкочастотной фильтрации с помощью гауссового фильтра 95 и 50 Гц соответственно.Нефильтрованные трассы показаны светлыми линиями. (C) Слева: широкоугольное изображение нейрона гиппокампа, экспрессирующего ElectricPk. Масштабная линейка = 15 мкм. Справа: Одиночные (светло-красная кривая) и усредненные (красная кривая) оптические и электрические ответы на вызванные ПД в нейроне слева. Оптические отклики регистрировали с помощью камеры NeuroCCD (RedShirt Imaging, LLC) на частоте 2 кГц. (D) Нормализованные кривые Δ V F для производных ArcLight A242–R217, S249–R217 и S249–Q217.242 и 249 представляют сайты слияния FP на линкере Ci VSD. 217 относится к самому внешнему аргинину на спирали S4 (Barnett et al., 2012; Han et al., 2013, 2014).

    Выравнивание последовательностей ортологов VSD из 29 видов показывает, что, хотя некоторые остатки в спиралях высококонсервативны, с поразительно похожими аргининовыми повторами в S4, в некоторых из этих сайтов существуют заметные различия. Комбинаторные мутации вариабельных остатков в Ci VSD () привели к развитию быстрого SEP/227D-содержащего сенсора Bongwoori. Ci VSD в Bongwoori содержит мутации в спиралях S2 и S4 (A154D/R229I), которые улучшают его кинетику, а также мутацию S4 R217Q, которая увеличивает чувствительность к отрицательным потенциалам. Зонд демонстрирует такое же τ-включение (∼8 мс), что и ArcLight, но быстрый компонент составляет большую долю общего экспоненциального затухания (91% против 50%). Его τ-off составляет 7 мс (Piao et al., 2015).

    Круговая перестановка FP

    Кинетика индикатора напряжения ограничена не только движениями датчика напряжения, но также эффективностью и скоростью связи между датчиком и флуорофором во время этих движений.

    Циркулярная перестановка FP, независимо от вида VSD, улучшает кинетику ответа. ElectricPK, быстрый датчик напряжения, был обнаружен во время скрининга на чувствительность к напряжению среди серии каркасов Ci VSD-cp-eGFP. Этот зонд, как и многие другие кандидаты с экрана, демонстрировал высокую скорость включения и выключения ~2 мс. ElectricPK может надежно разрешать короткие высокочастотные импульсы деполяризации в клетках HEK и AP в нейронах гиппокампа с дискретными оптическими ответами, не затуманенными накоплением дрейфа базовой линии (Barnett et al., 2012) ().

    Точно так же слитый белок Ci VSD-cp-mApple FlicR1 демонстрирует быструю кинетику (τ1 = ∼3 мс), при этом в реакциях преобладают быстрые компоненты. FlicR1 был разработан путем случайного мутагенеза и содержит восемь мутаций в своем VSD. Следовательно, неясно, является ли увеличение скорости результатом только круговой перестановки или дополнительных изменений кинетики ДМЖП (Abdelfattah et al., 2016). Это также относится к ASAP1/2, где как виды VSD, так и сборка FP способствуют ускоренному измерению напряжения.

    При активации напряжением Ci VSD претерпевает множественные структурные перестройки. В то время как первоначальный ответ быстрый и включает в себя движение заряда затвора, за ним следуют другие, более медленные и, вероятно, независимые от напряжения переходы. Эти два компонента динамики VSD отражены в FP и, следовательно, в флуоресцентном выходе GEVI (Kohout et al., 2008; Villalba-Galea et al., 2009). Все согласны с тем, что FP более медленных зондов напоминают оба типа движений VSD, тогда как FP более быстрых зондов фиксируют только первый.В частности, FP с круговой перестановкой эффективно сочетаются с быстрыми движениями, поскольку они более уязвимы к бочкообразным искажениям и быстро дестабилизируются из-за их неоптимальной конфигурации.

    Кинетика идеального датчика напряжения

    Учитывая, что ПД являются быстрыми событиями, можно предсказать, что GEVI с кинетикой менее миллисекунды может точно определить быструю последовательность ПД, предоставляя точную информацию как о частоте всплесков, так и о времени. Действительно, основанные на опсинах GEVI с субмиллисекундной кинетикой, возникающие в результате переходов состояний сетчатки в микросекундные временные масштабы, обеспечивают превосходное временное разрешение для обнаружения спайков (Maclaurin et al., 2013; Гонг и др., 2014, 2015; Цзоу и др., 2014). Однако было показано, что точность обнаружения пиков для зонда d’ зависит не от временной точности перекрытия между оптическим сигналом и формой сигнала AP, а скорее от продолжительности оптического сигнала, даже если она превышает продолжительность основного сигнала. шип (Wilt et al., 2013).

    В условиях ограниченного фотонного дробового шума современные детекторы предлагают d′ , который зависит от размера сигнала Δ F / F , яркости сенсора F 0 и времени затухания сигнала τ таким образом, что d ′≈(ΔF/F)•(F0τ)/2 (Уилт и др., 2013). Помимо улучшения чувствительности и яркости зондов, увеличение времени затухания оптического сигнала улучшает d’ , поскольку позволяет собирать дополнительные сигнальные фотоны за событие выше фона. Таким образом, оптический индикатор с быстрым подъемом, способный точно обнаруживать начало пика, но затянувшийся спад, может эффективно улучшить обнаружение пика. Тем не менее, такие индикаторы могут не обеспечивать точную информацию о времени всплесков, когда всплески достигают частот, превышающих разрешаемый предел индикатора.

    Таким образом, при выборе индикатора для его кинетики отклика можно рассмотреть экспериментальные приоритеты, например, требует ли данный биологический вопрос точного обнаружения пиков, оценки времени пиков или оценки подпороговых изменений напряжения. В то время как быстрые GEVI могут хорошо подходить для первого типа вопросов, более медленные GEVI могут быть ценными инструментами для изучения входных паттернов в локальных цепях, таких как изменения напряжения в результате синаптической передачи и медленные колебания напряжения в масштабах всей популяции.

    Зависимость оптических реакций от напряжения

    Главной целью разработки GEVI является разработка оптических индикаторов, чувствительных как к деполяризации, так и к гиперполяризации, обеспечивающих абсолютные измерения изменения напряжения и работающих в диапазоне физиологических напряжений для нейронов (напряжение полумаксимальной отклик флуоресценции В 1/2 ≈ -70 мВ). Все это может быть достигнуто путем оптимизации кривой датчика Δ V / Δ F .

    Свойства кривой Δ V F также определяются принципом измерения напряжения GEVI.Поскольку нативные ДМЖП активируются за счет деполяризации мембраны, зависимость движения заряда ворот от напряжения смещается в сторону положительных потенциалов. Это означает, что GEVI, включающие в себя ДМЖП дикого типа, будут работать только при сильном деполяризующем напряжении. Однако можно расширить диапазон чувствительности ДМЖП, включив в него менее деполяризующие и даже гиперполяризующие напряжения. Например, в калиевом канале Shaker нейтрализация самого внешнего положительного заряда в S4 (R362Q) приводит к перемещению управляющего заряда даже при напряжении ниже -70 мВ (гиперполяризация) (Seoh et al., 1996). Аналогичные мутации в VSD, полученных из фосфатазы, аналогичным образом расширяют их чувствительность, повышая полезность GEVI в широком диапазоне напряжений.

    Мутация Ci VSD R217Q и соответствующие мутации Gg VSD и Dr VSD (R153Q) повышают чувствительность GEVI к гиперполяризующим потенциалам и приводят к сдвигу влево Δ V / F . (). Соответственно, эти мутации получили широкое распространение в ряде исследований (Dimitrov et al., 2007; Цуцуи и др., 2008 г.; Бейкер и др., 2012; Хан и др., 2013, 2014; Пиао и др., 2015). Нейтрализация встречного заряда (D164) в спирали S2 также повышает чувствительность к отрицательным напряжениям (Piao et al., 2015). Повышая чувствительность к гиперполяризации, эти мутации служат для того, чтобы поместить V 1/2 ближе к мембранному потенциалу покоя. На практике, однако, V 1/2 сильно варьируется в зависимости от GEVI и во многих зондах по-прежнему имеет склонность к деполяризации (от -35 до -3 мВ) (Tsutsui et al., 2008; Джин и др., 2012 г.; Пиао и др., 2015). Расхождение предполагает, что дополнительные факторы, такие как связь между VSD и FP, могут играть роль в определении зависимости оптических откликов от напряжения.

    Помимо отрицательных сдвигов, наклон кривой Δ V / Δ F является еще одним индикатором чувствительности пробника при различных напряжениях. Например, датчик с большим наклоном, который показывает большое значение Δ F при небольших колебаниях напряжения, может быть полезен для мониторинга подпороговых изменений напряжения, тогда как GEVI с меньшим наклоном, показывающий такое же абсолютное значение Δ F , но при большие изменения напряжения могут быть подходящими для обнаружения пиков.По крайней мере один фактор, который, по-видимому, влияет на наклон кривой Δ V / Δ F , — это наличие заряженных остатков в S2 (Piao et al., 2015). Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы лучше понять зависимость оптических характеристик от напряжения, чтобы иметь возможность лучше адаптировать GEVI для удовлетворения конкретных экспериментальных потребностей.

    Заключение

    За два десятилетия, прошедшие с момента их открытия, мы начали понимать проблемы, связанные с разработкой GEVI, и стремимся к созданию более совершенных зондов с улучшенной мембранной экспрессией, чувствительностью к напряжению и отношением сигнал-шум, а также адаптацией их скорости и динамического диапазона напряжения. для удовлетворения экспериментальных потребностей.Поскольку каждый датчик GEVI обладает своими уникальными преимуществами и служит различным целям в лаборатории, может быть трудно представить себе идеальный датчик, который сочетает в себе лучшие качества всех существующих датчиков и обеспечивает единое решение для всех экспериментальных задач. Вместо этого цель разработки GEVI должна состоять в том, чтобы извлечь выгоду из потенциала данного зонда и максимизировать его полезность за счет стратегического и тщательного проектирования.

    Разработка генетически закодированных индикаторов напряжения включает как минимум три этапа: разработку, поставку и диагностику.Разработка начинается с анализа кристаллических структур белка, где это возможно, и изучения больших объемов литературы для разработки предварительного каркаса. Генетическая последовательность предполагаемого индикатора напряжения затем должна быть сконструирована путем направленной эволюции, а мутанты итеративно протестированы на предмет их работоспособности. В то время как в прошлом усилия с низкой и средней пропускной способностью были сосредоточены на ручном иерархическом скрининге яркости и чувствительности к напряжению, были предприняты значительные шаги для автоматизации этих процессов и повышения пропускной способности.Теперь можно демократизировать разработку напряжения с помощью роботизированных систем и последовательно оптимизировать миллионы вариантов по нескольким параметрам, таким как яркость, локализация мембраны и чувствительность к напряжению (Пяткевич и др., 2018). Аналогичным образом, в нашей лаборатории мы разработали полуавтоматические микроскопические системы, оснащенные полевыми электродами и чувствительными детекторами для одновременной оптимизации индикаторных конструкций в формате 96-луночных планшетов для характеристик напряжения, яркости и локализации при высокой пропускной способности и высоком содержании (Kannan и другие., 2018).

    После того как зонд адекватно оптимизирован для регистрации активности нейронов и охарактеризован в клеточной культуре, следующим шагом является его доставка животным для контроля его полезности в интактных цепях in vivo. Этого можно добиться путем инъекции рекомбинантных вирусов или электропорации плазмидной ДНК, кодирующей сконструированный GEVI. Выбор промотора, использование индуцибельных регуляторов экспрессии генов и время доставки генов может нацеливать экспрессию индикатора на определенные типы клеток на определенных стадиях развития.

    Последний шаг — диагностика. Хотя большая часть инноваций происходит на раннем этапе открытия, диагностика, пожалуй, является наиболее творческой фазой разработки GEVI. Он включает в себя разработку экспериментальной парадигмы, которая позволяет исследовать весь спектр приложений, в которых индикатор может быть полезен. Зонд можно использовать в качестве репортера спонтанной или вызванной стимулом активности, пластичности, зависящей от развития или опыта, обучения и памяти или других форм поведения. Хирургическая и оптическая установка может также нуждаться в настройке датчика.Возможно, потребуется адекватная демонстрация новых красных и дальнекрасных индикаторов на предмет их способности мультиплексироваться с оптогенетическими инструментами с синим смещением и другими типами индикаторов с минимальными оптическими перекрестными помехами.

    Разработка генетически закодированных индикаторов напряжения требует пересмотра основ механизмов, зависящих от напряжения, отличных от клеточной передачи сигналов кальция, а также понимания и оценки преимуществ датчиков напряжения, чтобы вдохновлять нас в напряженном процессе инноваций.Учитывая неуклонный прогресс в разработке зондов и ожидаемое развитие технологий визуализации, мы, вероятно, сейчас ближе к цели, чем когда-либо прежде.

  • Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *