Икк коробка испытательная переходная: Коробка испытательная КИП (прозрачная крышка) Инженерсервис купить цена

Содержание

Коробка испытательная переходная ИКП (аналог ИК, ИКК, латунь) TDM

Коробка испытательная переходная ИКП (аналог ИК, ИКК, латунь) TDM, Коробка испытательная, купить

Включите в вашем браузере JavaScript!

Коробка испытательная переходная ИКП (аналог ИК, ИКК, латунь) TDM SQ0836-0005

Артикул: SQ0836-0005

В корзину

Товар отсутствует

Предзаказ Оформить заказ

Добавить в сравнение Убрать из сравнения

Описание

Коробка испытательная переходная ИКП (аналог ИК, ИКК, латунь) TDM SQ0836-0005

Назначение

Испытательные переходные коробки (ИКП) предназначены для:

  • Возможности «закоротить» (зашунтировать) токовые цепи.
  • Отключения токовых цепей.
  • Отключения цепей напряжения по каждой фазе.
  • Подключения образцового электросчетчика.

Конструкция

  • Корпус изготовлен из пластика, стойкого к высоким температурам, обладающего высокой механической и коррозионной устойчивостью, отличными электроизоляционными свойствами, не подверженного воздействию агрессивных сред.
  • Все перемычки и клеммы у переходных испытательных коробок (ИКП) выполнены из латуни, т.к. она меньше подвергается коррозии, а также имеет лучшую электрическую проводимость по сравнению со сталью.
  • Испытательные коробки закрываются крышкой с винтом для пломбировки.
  • Для защиты общей шинки от замыканий на корпус с обратной стороны предусмотрена прокладка из электротехнического картона.

Упаковка

  • Упаковка производится по 4 штуки в термоусаживаемую пленку.

Коробка испытательная переходная ИКП (аналог ИК, ИКК) с прозр.

крышкой
Коробка испытательная переходная ИКП (аналог ИК, ИКК) с прозр. крышкой купить по выгодной цене. Выберите городМоскваСанкт-ПетербургЕкатеринбургНовосибирскВолгоградВоронежКазаньКрасноярскНижний НовгородОмскПермьРостов-на-ДонуСамараУфаЧелябинскТюменьКраснодарСаратовВладивостокТомскТверьОренбургПензаЯрославльСургут Пункты выдачи заказов в 104 городах России Отгрузим за 2 дня и доставим бесплатно

Характеристики

Артикул: 9900654

Производитель: CHINT

Цена без скидок:

488 ₽ с НДС

Продается упаковками: по 4 шт.

Наличие: Под заказ 4-12 недель

Комплектация и отгрузка за 2 дня Упаковка и доставка бесплатно

Реквизиты

ООО «БОНПЕТ», ИНН: 6672272461, КПП: 668601001, ОГРН: 1086672014990, Юридический адрес: 620017, г. Екатеринбург, ул. Фронтовых Бригад, д. 7

Cертификат дистрибьютора

Как получить скидку?

Если вы представляете электромонтажное, электрощитовое или промышленное предприятие, позвоните на 8 (800) 511 89 39 (бесплатно по РФ) или напишите на [email protected] ru и мы предложим вам индивидуальные условия работы.

переходная для электросчетчиков, монтаж коробки

Содержание статьи:

При установке измерительных приборов в силовые цепи трехфазного питания особое внимание уделяется приведению контролируемых величин к виду, удобному для подключения к электросчетчику. При значительных токовых нагрузках, достигающих 1000 Ампер, для этого используются специальные преобразовательные устройства – трансформаторы тока (ТТ). При их наличии обслуживание и ремонт подключаемых к линии приборов учета существенно усложняется.

Назначение и особенности ИКК

Испытательная коробка для счетчика

В ПУЭ особо оговаривается требование, касающееся подключения счетчика к действующим электросетям в части его коммутации через приспособление, называемое испытательная коробка (ИКК). При ее использовании удается закоротить вторичную цепь измерительного трансформатора, что позволяет обесточивать питающие линии по каждой из подводимых к счетчику фаз.

Подключение трансформатора тока через испытательную коробку позволяет превратить процедуру замены и проверки прибора учета в совершенно безопасное занятие. Помимо этого, отключать нагрузку от питающей линии в данном случае не обязательно.

Испытательные коробки для счетчика электроэнергии особо востребованы в следующих ситуациях:

  • для шунтирования контрольных цепей;
  • если возникла потребность в их полном отключении;
  • при необходимости блокирования напряжения по каждой из фаз;
  • для подсоединения к контролируемой линии измерительного устройства (электросчетчика).

Потребность в коробках ИКК также объясняется тем, что существует особая группа потребителей, каждый из которых не допускается отключать от электросети даже на короткое время. С учетом того, что периодически возникает потребность в проведении работ со счетчиком, коробка клеммная испытательная ИКК существенно упрощает все операции. В этом случае нет нужды в обесточивании линии питания и установке на место измерительного прибора замещающего его шунта.

Конструкция приспособления

Конструкция ИКК

Типовые переходные коробки выпускаются в нескольких исполнениях, различающихся своим видом и формой. Чаще всего они имеют вид прямоугольной колодки с толстыми стенками, изготовленными из прочного и негорючего материала (карболита или пластика).  В таком исполнении коробка напоминает подложку с размещенными на ней группами клемм, образующих так называемую «зажимную клеть».

По ее краям делаются сквозные отверстия, используемые для крепления ИКК к стенкам распределительного щита. Ее соединительные контакты изготавливаются на основе латуни или оцинкованной стали (иногда для этого используется фосфористая бронза). Некоторые модели коробок комплектуются такими дополнительными элементами, как фланец или рычажок, упрощающий процесс монтажа.

Переходные контакты выполняются в виде подпружиненных пластин или винтовых фиксаторов, размещаемых на токопроводящих пластинах из латуни, жести или стали. Их применение объясняется устойчивостью этих материалов к коррозии и высокой проводимостью. Сверху колодка закрывается прозрачной крышкой из пластика, надежно фиксируемой на основании. При эксплуатации испытательного приспособления совместно с электросчетчиком его крышка также опечатывается. Для этого в ней предусмотрены сквозные ушки для навешивания пломбы или небольшое отверстие под контрольный винт (шуруп). Прозрачность защитного покрытия позволяет визуально контролировать расключение контактных групп.

Типовые различия

Испытательная коробка в электрощитке

Все испытательные клеммные коробки прежде всего различают по типу сетевого питания. В соответствии с этим показателем они делятся на следующие виды:

  • колодки, устанавливаемые в цепях питания 380 Вольт;
  • те же изделия, но рассчитанные на 220 Вольт;
  • низковольтные образцы, предназначенные для установки в сети 110 Вольт.

Изделия принято отличать по форме и рабочим размерам. Согласно этим признакам они могут быть круглыми, прямоугольными или квадратными, небольшого размера или укрупненной серии.

В общем случае испытательные коробки классифицируются по следующим характерным признакам:

  • назначение;
  • способ монтажа;
  • количество рядов на подложке;
  • число контактных групп в каждом из них;
  • тип фиксации и марка провода;
  • исполнение (угловые коробки или прямые).

По назначению изделия используются совместно измерителями либо предназначаются для обычных коммутационных операций. Они могут монтироваться на DIN рейку или устанавливаться в кросс-модуль. Возможное количество рядов и контактных групп в этих приспособлениях – один или два с числом контактов от 3-х и более.

В соответствии с используемым способом фиксации все коробки бывают для винтового, барьерного и фиксированного (нажимного) крепления. Марка подключаемого провода выбирается в зависимости от типа используемых в коробке клемм. Винтовые и концевые крепления подходят для всех типов проводников, а в пружинные и ножевые зажимы обычно вставляются их одножильные аналоги. Однако основное различие испытательных колодок для счетчиков в схеме подключения, согласно которой они применяются для одного учетного устройства либо сразу для нескольких образцов.

Испытательные коробки ИКК выпускаются большинством крупных производителей электротехнического оборудования, использующим при их изготовлении различные материалы. Этот факт подтверждается наличием у ряда изделий различных сертификатов качества.

Монтаж устройства

Схема монтажа ИКК

Приспособления востребованы при прокладке новых электрических линий и при необходимости их модернизации. При монтаже обязательно выполняются требования ПУЭ, касающиеся правил эксплуатации испытательных коробок. Согласно нормативам, для размещения ИКК потребуется подготовить специально оборудованное место, защищенное от проникновения посторонних лиц и доступное для обслуживающего персонала.

На клеммах коробки допускается объединять только провода из однородных металлов, имеющих электрохимическую совместимость.

Усилие затяжки контактных винтовых соединений не должно быть более 2,5 Nm, что гарантирует сохранность клемм. Кроме того, они не должны иметь повреждений и следов явных дефектов. Фиксация корпуса ИКК в месте установки выполняется только механическим способом – его прикручиванием или закреплением с помощью специальных защелок. Коробка обычно монтируется в электрическом шкафу сразу же после электросчетчика.

Пример подключения

Действия при снятии ПУ

Расключение реального прибора учета (ЦЭ6803 В100/10 Т1, например) посредством испытательной коробки осуществляется по заранее подготовленной схеме.

Согласно ПУЭ, все трехфазные счетчики должны подключаться через токовые преобразователи и совмещенную с ними переходную коробку.

При выборе трансформаторов удобнее воспользоваться изделием ТОП-0,66 с коэффициентом передачи тока 200/5. В качестве примера подключения рассмотрим коробку КИ 10 или же Б3179, выпускаемую МЭТЗ. Вес не превышает 0,6 кг, габариты – 68х220х33 мм. Последовательность расключения этих изделий:

  1. В рабочем щитке монтируется счетчик, а затем – сама испытательная коробка и трансформаторы тока.
  2. ТТ по каждой из фаз объединяются по схеме «звезда»; при этом общий вывод надежно заземляется.
  3. От него до корпуса коробки протягиваются провода сечением 1,5 мм².
  4. От счетчика также прокладываются три жилы (2,5 мм²).

Для удобства монтажа перед прокладкой все провода обязательно маркируются: на них указываются начала всех токовых фазных обмоток, а также общий вывод. При этом проводники от электросчетчика заводятся в коробку с верхней ее части, а затем поочередно расключаются в контактной группе. Она должна иметь большую площадь пластин, чем те же контакты, предназначенные для отводов от токовых трансформаторов (они располагаются с нижней стороны коробки).

Расключенная испытательная пластина закрывается сверху крышкой, после чего изделие готово к эксплуатации.

При необходимости проведения каких-либо операций с электрическим счетчиком для его снятия потребуется лишь удалить перемычки в ИКК. После этого цепь ее соединения с учетным прибором разрывается.

Нюансы использования

Испытательные коробки как конструкции простейшего типа не нуждаются в особом обслуживании, что не означает их абсолютной надежности. Согласно требованиям действующих нормативов, в процессе эксплуатации ИКК рекомендуется регулярно подтягивать контакты винтовых зажимов. В процессе эксплуатации проводники нагреваются и слегка деформируются, что вызывает ослабевание соединений.

К коробкам с контактами зажимного типа таких требований обычно не предъявляется. К тому же обращаться с ними намного удобнее, поскольку для отключения измерителя дополнительного инструмента не потребуется.

Процедуры, связанные с установкой, демонтажем, а также вскрытием и последующим за этим пломбированием коробки проводятся только квалифицированными специалистами.

08.

36.01 Коробка испытательная для счетчиков ИКП (аналог ИК, ИКК)

по порядкупо росту ценыпо снижению ценыпо новизне

  • SQ0836-0005

    Купить Перезвоните мнеОставьте свой номер телефона и представитель компании свяжется с вами.
  • SQ0836-0006

    Купить Перезвоните мнеОставьте свой номер телефона и представитель компании свяжется с вами.
  • SQ0836-0003

    Купить Перезвоните мнеОставьте свой номер телефона и представитель компании свяжется с вами.
  • SQ0836-0004

    Купить Перезвоните мнеОставьте свой номер телефона и представитель компании свяжется с вами.
  • SQ0836-0001

    Купить Перезвоните мнеОставьте свой номер телефона и представитель компании свяжется с вами.
  • SQ0836-0002

    Купить Перезвоните мнеОставьте свой номер телефона и представитель компании свяжется с вами.

Коробка испытательная переходная | Блог инженера теплоэнергетика

Для чего нужно и как подключить?

     Испытательные переходные коробки (клеммники), или, сокращенно – КИП, обычно используют, если нужно подключение счетчиков через трансформатор тока (ТТ). Это является крайне важным для, так называемых, потребителей первой категории, то есть когда перерыв в снабжении электричеством недопустим.

     Использование строго регулируется правилами устройства электроустановок (ПУЭ).

Что из себя представляет?

     Если обратить внимание на внешний вид коробки, то можно заметить, что контакты особым образом сгруппированы, также на них присутствуют перемычки. Это нужно для того, чтобы, когда подключался образцовый прибор, не нужно было отключать основной. При этом, при подключении образцового прибора к свободным концам клемм, перемычки размыкаются. Материал перемычек – латунь. Благодаря ей, обеспечивается лучшая электрическая проводимость ( в отличие от той же стали). Также латунь меньше подвержена коррозийным процессам.

     Чтобы обеспечить безопасное отключение и снятие счетчика (например, если его нужно проверить, или заменить), на этот счет используются колодки.
Крышки у таких коробок бывают черного цвета, либо бесцветные (прозрачные). Последний вариант является наиболее предпочтительным, так как позволяет взглянуть на схему подключения, и проверить состояние контактов, не открывая крышки.

     Также коробка оснащена специальным винтом, имеющим сквозное отверстие. Он нужен для пломбировки. При этом, пломба снимается и устанавливается в одно время со счетчиком. Снятие и установка пломбы на ней происходит одновременно со счетчиком.

Для чего может использоваться?

     Как уже было сказано выше, в основном КИП используют, если нужно подключить счетчик через ТТ.
Также такая испытательная коробка позволяет следующее:

• зашунтировать токовую цепь

• отключить токовую цепь

• отключить цепь по каждой конкретной фазе

• подключить трехфазный индукционный и электронный счетчик

• включить образцовый счетчик для проверки, не отключая нагрузку потребления.

     Все это позволяет не снимать напряжение с электроустановки, когда идет замена счетчика. Также можно не отключать нагрузку потребителя, если нужно подключить образцовый счетчик с целью его проверки.

     Далее мы рассмотрим подробнее, как происходит процесс подключения такой испытательной коробки.

Как произвести правильное подключение?

     При установке и подключении испытательных блоков необходимо соблюдать строгий порядок, в соответствии с правилами ПЭУ. Там четко указано, что цепи учета электроэнергии нужно выводить на специально предназначенные для этого зажимы, либо вот на такие испытательные коробки.

     В соответствии с правилами, подключение трехфазных индукционных или электрических счетчиков через испытательную коробку чрезвычайно важно. Как уже было сказано выше, это позволит не отключать нагрузку потребления, если необходимо включить образцовый счетчик для проверки. Также это поможет закоротить вторичную цепь трансформатора тока, либо отключить цепь напряжения (при том, на каждую фазу счетчика при его замене).

     Будьте внимательны, все работы по: монтажу, демонтажу, подключению и отключению счетчиков и переходных испытательных коробок могут производиться только квалифицированными специалистами. Также эти люди должны иметь специальный допуск (для электроустановок, напряжение которых доходит до 1000 В).

     При этом, стоит отметить, что в правилах устройства электроустановок нет конкретных схем по подключению. Но там есть строгие требования к такого рода схемам (в том числе, по возможному закорачиванию, пломбированию). Поэтому, эти требования также необходимо соблюдать.

     Зачастую, благодаря установке приборов учета для потребителей, через трансформаторы тока (ТТ), стоимость электроснабжения удешевляется. Но при этом, повышается его надежность. Это связано с тем, что сила тока приборов учета, предназначенных для прямого включения, не высока. Но это ограничение снимается, если использовать трансформаторы тока.

     Благодаря этому, непосредственно на том месте, где и происходит установка счетчика, можно будет: заменить и проверить схему присоединения, определиться с погрешностью в измерениях. И при этом нагрузочный ток будет оставаться в наличии, нет необходимости отключать потребителей.

     Наиболее универсальным, распространенным способом подключения, который способен обеспечить безопасность обслуживания, является: подключение счетчиков через ТТ, при помощи переходной коробки для низковольтной сети (220В).

Здесь приведена возможная схема подключения.

     Для того, чтобы «закоротить» токовую цепь, достаточно будет просто вкрутить винт в отверстие. Напомню, цепь учета нужно выводить на специально предназначенные для этого зажимы (выбрав отдельные сборки, или же секции из общего ряда). Когда зажимов нет, выбирается установка испытательного блока.

     Отсоединять провода и кабель, когда включен образцовый счетчик, не требуется, если есть такие зажимы. Вторичная цепь трансформатора тока будет закорочена, а токовая цепь и цепь напряжения счетчика отключена.

     После закорочения токовой цепи, можно будет снять перемычки. Если будет нужно отключить цепь напряжения по каждой из фаз, то достаточно сначала открутить винт, а потом уже снять конкретную необходимую перемычку. Пломбирование также не составит труда, сборки и коробки зажимов электросчетчиков имеют специально предназначенную для этого конструкцию.

Подводя итог:

• Для начала нужно закоротить токовую цепь трансформатора тока при помощи специальных винтов;

• Затем снять перемычки для отключения токовой цепи прежнего счетчика. Это делается для того, чтобы исключить его влияние на показатели образцового счетчика;

• Временно подключить к переходной коробке образцовый счетчик;

• Выкрутить винты, тем самым разомкнув цепь трансформатора.

    Обратите внимание, цепь вторичных обмоток трансформатора тока обязательно должна быть заземлена и закорочена, а напряжение снято. Это делается для безопасности. Для этого используются специальные колодки. Использование таких колодок позволит безопасно отключить и снять электрический счетчик для дальнейшей проверки и замены.

     Дополнительно, чтобы защитить общую шинку от замыкания, на корпусе коробки, с обратной стороны, имеется картонная прокладка. Стоит отметить, что использование таких переходных коробок происходит только, если счетчик включается через измерительные трансформаторы тока. Если счетчик имеет прямое включение, такую коробку никогда не используют.

     С помощью такого устройства можно подключить прибор для снятия замеров, при этом не нарушая схемы.
В целом, переходная коробка является очень полезной вещью. С помощью нее можно проверить все прямо на месте, при этом не потребуется демонтаж. Также можно будет заменить счетчик с непрямым включением, при этом потребитель не будет обесточен. Это действительно удобно.


Теломер-независимый Rap1 является адаптером IKK и регулирует экспрессию NF - ?? B-зависимого гена

Сейед Мостафа Мир, 1–3 Садра Самаварчи Тегерани, 4,5 Гольназ Гударзи, 4,5 Захра Джамалпур, 1 Джаханбахш Асади, 6 Нафисех Хелгати, 7 Дурди Куджек, 2,3 Махмуд Маниати8 1 Центр исследования травм, Университет медицинских наук AJA, Тегеран, Иран; 2 Студенческий исследовательский комитет, Университет медицинских наук Баболь, Баболь, Иран; 3 Исследовательский центр клеточной и молекулярной биологии, Институт медицинских исследований, Университет медицинских наук Баболь, Баболь, Иран; 4 Кафедра клинической биохимии, Школа медицины, Тегеранский университет медицинских наук, Тегеран, Иран; 5 Студенческий научно-исследовательский центр Тегеранского университета медицинских наук, Тегеран, Иран; 6 Исследовательский центр метаболических расстройств, Голестанский университет медицинских наук, Горган, Иран; 7 Кафедра клинической биохимии, Школа медицины, Урмийский университет медицинских наук, Урмия, Иран; 8 Школа медицины, Университет медицинских наук Ахваза Джундишапура, Ахваз, Иран Переписка: Захра Джамалпур, Исследовательский центр травм, Университет медицинских наук AJA, Тегеран, Иран Тел. + 989126011941 Электронная почта z_jamalpoor2000 @ yahoo.comAbstract: На развитие и контроль старения влияют разные факторы. Хорошо известно, что прогрессирующее укорочение теломер является одним из молекулярных механизмов старения. Комплекс шелтерина состоит из шести специфичных для теломер белков, которые участвуют в защите концов хромосом. В частности, этот жизненно важный комплекс защищает теломеры от деградации, предотвращает активацию нежелательных систем репарации, регулирует активность теломеразы и играет решающую роль в клеточном старении и патологиях, связанных со старением.В этом обзоре исследуются организация и функция теломерной ДНК, а также механизм теломер во время старения, а затем обсуждается критическая роль компонентов шелтерина и их изменений в процессе старения. Ключевые слова: старение, укрывающий комплекс, теломеры

Потеря субъединиц IKK ограничивает передачу сигналов NF-κB в инфицированных реовирусом клетках

РЕЗЮМЕ

Вирусы обычно противодействуют путям врожденного иммунитета, которые в первую очередь управляются ядерным фактором-κB (NF-κB), регуляторным фактором интерферона (IRF) и сигнальным преобразователем и активатором транскрипции (STAT) ) семейство факторов транскрипции. Такая стратегия позволяет вирусам уклоняться от иммунного надзора и максимизировать их репликацию. Используя беспристрастный подход, основанный на РНК-seq, для измерения экспрессии генов, индуцированной трансфицированной вирусной геномной РНК (vgRNA) и инфекцией реовируса, мы обнаружили, что реовирус млекопитающих подавляет передачу сигналов врожденного иммунитета клетки-хозяина. Мы обнаружили, что хотя и vgRNA, и реовирусная инфекция вызывают сходную программу экспрессии IRF-зависимых генов, экспрессия генов, управляемая семейством факторов транскрипции NF-κB, ниже в инфицированных клетках.Сильные агонисты NF-κB, такие как фактор некроза опухоли альфа (TNFα) и vgRNA, не смогли вызвать экспрессию зависимого от NF-κB гена в инфицированных клетках. Мы демонстрируем, что передача сигналов NF-κB блокируется из-за потери критических членов комплекса ингибитора KappaB-киназы (IKK), NF-κB Essential MOdifier (NEMO) и IKKβ. Утрата компонентов комплекса IKK предотвращает ядерную транслокацию и фосфорилирование NF-κB, тем самым предотвращая экспрессию генов. Наши исследования демонстрируют, что реовирусная инфекция избирательно блокирует NF-κB, что, вероятно, противодействует его противовирусным эффектам и способствует эффективной репликации вируса.

ВАЖНОСТЬ Клетки-хозяева реагируют на репликацию вируса в инфицированных клетках и предотвращают инфицирование соседних, еще не инфицированных клеток. Семейство белков NF-κB важно для клетки, чтобы опосредовать этот ответ. В этом исследовании мы показываем, что в клетках, инфицированных реовирусом млекопитающих, NF-κB неактивен. Кроме того, мы демонстрируем, что NF-κB становится неактивным, поскольку вирусная инфекция приводит к снижению уровней вышестоящих посредников (называемых IKK), которые необходимы для функции NF-κB.Основываясь на предыдущих доказательствах того, что активный NF-κB ограничивает реовирусную инфекцию, мы заключаем, что инактивация NF-κB представляет собой вирусную стратегию создания клеточной среды, благоприятной для репликации вируса.

ВВЕДЕНИЕ

Врожденный иммунный ответ млекопитающих является эффективным ответом на вирусное вторжение. Первичный механизм врожденного контроля вирусной инфекции - выработка противовирусных цитокинов. Паракринная передача сигналов этими цитокинами устанавливает противовирусное состояние в соседних, неинфицированных клетках, делая их невосприимчивыми к вирусной инфекции и ограничивая распространение вируса в организме хозяина (1).Экспрессия этих цитокинов находится под контролем двух основных факторов транскрипции, ядерного фактора-κB (NF-κB) и фактора регуляции интерферона 3 (IRF3) (2). NF-κB и IRF3 активируются после сигнала, который инициируется внеклеточным зондированием ассоциированных с патогенами молекул, при прохождении через клеточные пути поглощения или внутри клетки (2). Для РНК-вирусов восприятие клеточной поверхности или эндосом геномного материала через Toll-подобные рецепторы (TLR) или цитоплазматическое восприятие через RIG-I-подобные рецепторы (RLR) являются двумя основными механизмами распознавания патогенов (2).Животные модели и клеточные линии, в которых отсутствует какой-либо компонент сигнального модуля - сенсор, факторы транскрипции или цитокины, - обычно более восприимчивы к вирусным инфекциям, чем модели с интактным иммунным ответом (3–6).

Поскольку эти начальные стадии врожденного иммунного ответа настолько эффективны для ограничения репликации вируса, большинство вирусов развили один или несколько механизмов, ограничивающих производство или активность этих антивирусных цитокинов (7, 8). Часто вирусы противодействуют иммунному ответу, изолируя, разрушая или инактивируя один или несколько клеточных компонентов, которые необходимы для противовирусного ответа на основе цитокинов (7, 8).Нацеливание на функцию фактора транскрипции является широко используемой вирусной стратегией, возможно, потому, что факторы транскрипции служат критическим узлом, который контролирует экспрессию множества противовирусных молекул. Среди них NF-κB может контролировать функцию широкого спектра провоспалительных хемокинов и цитокинов (9). Семейство факторов транскрипции NF-κB состоит из пяти различных субъединиц, которые функционируют как гомо- или гетеродимеры. Классический комплекс NF-κB (далее называемый NF-κB), состоящий из субъединиц p65 и p50, является критическим регулятором экспрессии антивирусных генов (9). В неактивном состоянии он секвестрируется в цитоплазме с помощью ингибитора белков-ингибиторов κB (IκB) (9). Транскрипционная активность NF-κB регулируется комплексом киназы IκB (IKK) (9). Комплекс IKK, состоящий из IKKα, IKKβ и NEMO, фосфорилирует IκB, что приводит к его убиквитинированию и деградации. Освобожденный от своего ингибитора, NF-κB способен перемещаться в ядро, связываться с ДНК и инициировать экспрессию генов. Функция трансактивации NF-κB также требует IKK-опосредованного фосфорилирования субъединицы p65 (10).

Ортореовирус млекопитающих (реовирус) представляет собой вирус дцРНК, который реплицируется в цитоплазме клетки-хозяина (11). Как и у большинства других вирусов, на патогенез реовируса влияет передача сигналов NF-κB (12). В модели новорожденных мышей NF-κB играет противовирусную роль в сердце. По сравнению с мышами дикого типа, мыши NF-κB p50 - / - демонстрируют более высокие титры вирусов, повреждение тканей и гибель клеток, что указывает на то, что NF-κB в данном контексте является противовирусным. Этот результат, по крайней мере частично, связан с неспособностью мышей p50 - / - продуцировать IFNβ.Несмотря на то, что вирусная геномная РНК остается внутри двух концентрических белковых оболочек, составляющих капсид реовируса, текущая модель утверждает, что врожденный иммунный ответ инициируется, когда геномная РНК поступающих вирионов воспринимается RLR - RIG-I и MDA5 ( 9, 13). Ощущение РНК приводит к активации IRF3 и NF-κB, что приводит к продукции IFN и других воспалительных цитокинов (14). Ограничивает ли реовирус этот противовирусный ответ, тщательно не изучалось.

В этом исследовании мы исследовали, подавляет ли реовирус передачу сигналов врожденного иммунитета после инфекции. Используя RNA-seq, мы обнаружили, что активность NF-κB ингибировалась в инфицированных клетках после обработки несколькими агонистами, включая вирусную геномную РНК (vgRNA) и фактор некроза опухоли альфа (TNFα). Мы обнаружили, что это ингибирование было связано со снижением клеточных уровней компонентов IKK, IKKβ и NEMO. Потеря комплекса IKK привела к ингибированию ядерной транслокации NF-κB и, как следствие, к блокаде его функции трансактивации.Блокада экспрессии вирусного гена предотвращала потерю IKK, предполагая, что события вирусной репликации после входа в клетку необходимы для потери IKK и ингибирования NF-κB. Это исследование подчеркивает ранее неизвестный механизм, с помощью которого реовирусная инфекция притупляет врожденный иммунный ответ хозяина.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Экспрессия зависимого от NF-κB гена заблокирована в клетках, инфицированных реовирусом

Геномная дцРНК в частицах реовируса служит ассоциированным с патогеном молекулярным паттерном, который активирует врожденный иммунный ответ через RIG-I и MDA5 (15-17) .Чтобы определить, изменяет ли реовирусная инфекция этот ответ, мы сравнили ответ клетки-хозяина в клетках L929 после трансфекции vgRNA с ответом после инфицирования штаммом реовируса 3 типа Abney (T3A). Используя анализ РНК-seq, мы обнаружили, что трансфекция вирусной РНК индуцировала экспрессию 978 генов (рис. 1A, 1B). Для этого анализа мы рассмотрели только те гены, экспрессия которых увеличилась в> 4 раза (log 2 FC> 2) и были идентифицированы с коэффициентом ложного обнаружения (FDR) <0.05 существенно отличаться. Мы использовали iRegulon, который предсказывает регуляторы транскрипции для набора генов, экспрессируемых аналогичным образом, с помощью нормированной оценки обогащения (NES) (18). Высокий NES для данного фактора транскрипции указывает на то, что многие гены в наборе, вероятно, регулируются этим фактором транскрипции. Мы использовали эту программу, чтобы определить, какие факторы транскрипции, скорее всего, регулируют гены, индуцированные после обработки vgRNA. Мы обнаружили, что из 978 генов, индуцированных vgRNA, самые высокие оценки NES были присвоены NF-κB и IRF с оценкой 4.0 и 10.0 соответственно (рис. 1С). Как и ожидалось, реовирусная инфекция вызвала подобный профиль экспрессии гена. 65% из 978 генов, индуцированных vgRNA, также были индуцированы реовирусом. Когда мы использовали iRegulon для прогнозирования факторов транскрипции, которые регулируют гены, индуцированные реовирусной инфекцией, мы обнаружили, что, хотя гены, регулируемые IRF, были обогащены в этом списке (NES 12,0), гены, регулируемые NF-κB, отсутствовали. Удивительно, но NES для NF-κB упал ниже порогового значения 3.0, указывая на то, что гены-мишени NF-κB не были обогащены набором генов, индуцированным реовирусной инфекцией (рис.1С). Из 978 генов, индуцированных vgRNA, описанных выше, 35% генов (339 из 978) экспрессировались в меньшей степени в клетках, инфицированных реовирусом. Используя iRegulon, мы предсказали, что гены-мишени NF-κB были обогащены в этом наборе, так как NES для NF-κB увеличился с 4,0 до 4,9 (рис. 1C). Эти данные предполагают, что семейства факторов транскрипции NF-κB и IRF по-разному регулируются в клетках, трансфицированных РНК, и клетках, инфицированных реовирусом. Таким образом, наблюдаемые различия в профилях экспрессии генов в клетках, трансфицированных РНК и инфицированных реовирусом, не связаны с различиями в восприятии РНК.Вместо этого это различие может быть связано с тем, что реовирус не может активировать сигнальный путь NF-κB или потому, что он разработал механизм, блокирующий передачу сигналов NF-κB.

Рис. 1.

Штамм реовируса T3A подавляет экспрессию NF-κB зависимого гена. (A) Клетки ATCC L929 трансфицировали 0,5 мкг vgRNA. Через 7 часов после трансфекции суммарную РНК экстрагировали и подвергали анализу РНК-seq. График вулкана, показывающий гены, экспрессия которых индуцирована> 4-кратно (log 2 FC> 2) с FDR <0,05 по сравнению с ложно инфицированными клетками, показаны в рамке.(B, C) Клетки ATCC L929 трансфицировали 0,5 мкг vgRNA в течение 7 часов или инфицировали 10 БОЕ / клетку штамма реовируса T3A в течение 20 часов. Тотальную РНК экстрагировали и подвергали анализу РНК-seq. (B) Показана тепловая карта, сравнивающая экспрессию генов, показанных в обведенной рамкой области на фиг. 1A, после трансфекции vgRNA и инфицирования T3A. (C) Диаграмма рассеяния, сравнивающая экспрессию генов, показанных в области, выделенной рамкой на фиг. 1A, после трансфекции vgRNA и инфицирования T3A. Черные точки обозначают гены, экспрессия которых существенно не отличается в двух вариантах лечения. Красные точки представляют собой гены, которые в значительно меньшей степени экспрессируются в клетках, инфицированных T3A. Также показан анализ iRegulon обоих наборов генов. (D, E) Клетки ATCC L929 адсорбировали PBS (фиктивный) или 10 БОЕ / клетку T3A. После инкубации при 37 ° C в течение 20 часов клетки трансфицировали 0,5 мкг вирусной РНК в течение 7 часов. Тотальную РНК экстрагировали и подвергали анализу РНК-seq. (D) Показана тепловая карта, сравнивающая экспрессию генов, показанных в обведенной рамкой области на фиг. 1A, после трансфекции vgRNA ложно инфицированных и инфицированных T3A клеток.(E) Диаграмма рассеяния, сравнивающая экспрессию генов, показанных в области, выделенной рамкой на фиг. 1A, после трансфекции vgRNA ложно инфицированных и инфицированных T3A клеток. Черные точки обозначают гены, экспрессия которых существенно не отличается в двух вариантах лечения. Красные точки представляют собой гены, которые в значительно меньшей степени экспрессируются в клетках, инфицированных T3A, трансфицированных vgRNA. Также показан анализ iRegulon обоих наборов генов.

Чтобы различить эти возможности, мы определили, ингибирует ли реовирусная инфекция vgRNA-индуцированную активацию NF-κB.С этой целью мы сравнили, отличается ли экспрессия генов в неинфицированных клетках, трансфицированных vgRNA, от инфицированных клеток, трансфицированных vgRNA. Как описано выше, трансфекция vgRNA неинфицированных клеток индуцирует экспрессию 978 генов (фиг. 1A). В инфицированных клетках, однако, vgRNA не удалось индуцировать 13% этих генов (133 из 978) (рис. 1D, 1E). Мы использовали iRegulon, чтобы предсказать, что наиболее вероятным регулятором транскрипции генов, экспрессия которых подавлялась реовирусной инфекцией, был NF-κB с NES 6.1. Эти данные позволяют сделать вывод, что реовирус блокирует экспрессию зависимого от NF-κB гена даже в присутствии сильного агониста.

vgRNA и реовирусная инфекция активируют NF-κB ниже по течению через общий набор сенсоров, которые обнаруживают РНК (15-17, 19). Чтобы определить, ограничивается ли ингибирующее действие реовируса на экспрессию зависимых от NF-κB генов только экспрессией генов, индуцированной вирусной РНК, мы использовали TNFα, мощный стимулятор передачи сигналов NF-κB. Анализ РНК-seq неинфицированных клеток, обработанных TNFα, с использованием тех же критериев, описанных выше, привел к положительной регуляции 32 транскриптов (рис.2А). Напротив, TNFα не оказывает значительного влияния на экспрессию генов в клетках, инфицированных T3A (фиг. 2B, 2C, 2D). Эти данные указывают на то, что инфицирование клеток T3A приводит к блокаде NF-κB-зависимой транскрипции. vgRNA и TNFα инициируют передачу сигналов NF-κB разными путями. Таким образом, наш анализ показывает, что реовирус блокирует передачу сигналов NF-κB на этапе, который является общим для обоих сигнальных путей.

Рис. 2.

Штамм T3A реовируса ингибирует TNFα-стимулированную экспрессию NF-κB-зависимого гена.(A) Клетки ATCC L929 обрабатывали 10 нг / мл TNFα. Через 1 час после обработки была извлечена общая РНК и подвергнута анализу РНК-seq. График вулкана, показывающий гены, экспрессия которых индуцирована> 4 раза (log 2 FC> 2) с FDR <0,05 по сравнению с необработанными клетками, показаны в рамке. (B, C, D) Клетки ATCC L929 адсорбировали 10 БОЕ / клетку T3A. После инкубации при 37 ° C в течение 20 часов клетки обрабатывали 0 или 10 нг / мл TNFα в течение 1 часа. Тотальную РНК экстрагировали из клеток и подвергали анализу РНК-seq.(B) Диаграмма рассеяния, сравнивающая экспрессию генов, показанных в обведенной рамкой области на фиг. 2A, после инфицирования T3A с TNFα или без него. Показана линия тренда, показывающая линейную регрессию и коэффициент детерминации. (C) Диаграмма рассеяния, сравнивающая экспрессию генов, показанных в области, выделенной прямоугольником на фиг. 2A, после обработки TNFα ложно инфицированных и инфицированных T3A клеток. Показана линия тренда, показывающая линейную регрессию и коэффициент детерминации. (D) Тепловая карта, сравнивающая экспрессию генов, показанных в области рис.2А после обработки TNFα ложно инфицированных и инфицированных T3A клеток. Также показана экспрессия того же набора генов в клетках, инфицированных T3A.

Активность киназы IκB (IKK) снижена в клетках, инфицированных реовирусом

Для проверки наших анализов RNA-seq мы измерили способность vgRNA и TNFα индуцировать экспрессию гена-мишени NF-κB в клетках, инфицированных реовирусом, с использованием RT -qPCR. Для этих экспериментов мы отслеживали уровни транскриптов IκBα, гена-мишени NF-κB. Поскольку белок IκBα ингибирует ядерную транслокацию NF-κB, его экспрессия служит ингибитором обратной связи активности NF-κB (20).В соответствии с нашими данными RNA-seq, мы обнаружили, что реовирус в значительной степени подавляет экспрессию IκBα после лечения любым из агонистов (рис. 3A, 3B). Поскольку действие реовируса на оба агониста NF-κB было эквивалентным, мы использовали TNFα до конца наших экспериментов. Обработка клеток TNFα должна способствовать ядерной транслокации p65. Мы измерили ядерные уровни p65 в ложно инфицированных и инфицированных реовирусом клетках, обработанных TNFα. Как и ожидалось, обработка ложно инфицированных клеток TNFα приводила к накоплению p65 в ядре в течение 1 часа (рис.3С). Предшествующее инфицирование T3A предотвращало накопление р65 в ядре, вызванное TNFα. Эти данные согласуются с предыдущими доказательствами, свидетельствующими о том, что деградация белка IκBα блокируется в инфицированных реовирусом клетках (21). Расщепление IκBα инициируется фосфорилированием IκBα комплексом IκB-киназы (IKK), что приводит к полиубиквитинированию и последующей деградации IκBα протеасомой (9). Таким образом, снижение ядерных уровней p65 в клетках, инфицированных T3A, обработанных TNFα, может быть связано с отсутствием достаточных уровней активной IKK.Помимо IκBα, комплекс IKK также фосфорилирует p65 по Ser536 перед ядерной транслокацией (10). IKK-опосредованное фосфорилирование p65 Ser536 имеет решающее значение для экспрессии NF-κB-зависимого гена и считается маркером активности IKK (10). Чтобы определить, нарушена ли активность IKK в T3A-инфицированных клетках, мы оценили способность TNFα способствовать фосфорилированию p65 по Ser536. В то время как TNFα сильно индуцировал фосфорилирование p65 в ложно инфицированных клетках, как базальное, так и индуцированное TNFα фосфорилирование p65 резко снижалось в T3A-инфицированных клетках (рис.3D). Таким образом, в клетках, инфицированных реовирусом, транслокация и фосфорилирование ядра p65, оба из которых требуют комплекса IKK, ингибируются. Эти данные предполагают, что реовирус может ингибировать экспрессию зависимого от NF-κB гена из-за неактивности комплекса IKK.

Рис. 3.

Реовирус ингибирует передачу сигналов NF-κB выше экспрессии гена. (A) Клетки ATCC L929 адсорбировали PBS (фиктивный) или 10 БОЕ / клетку T3A. После инкубации при 37 ° C в течение 20 часов клетки трансфицировали vgRNA и инкубировали в течение 7 часов.РНК экстрагировали из клеток, и уровни мРНК IκBα относительно контроля GAPDH измеряли с помощью RT-qPCR. Экспрессия IκBα в ложно инфицированных клетках, обработанных агонистом vgRNA, была установлена ​​на 100%. Экспрессия гена в каждой повторности, среднее значение и стандартное отклонение показаны ***, P <0,001 по t-критерию Стьюдента по сравнению с имитацией инфицированных клеток, трансфицированных vgRNA. (B) Клетки ATCC L929 адсорбировали PBS (фиктивный) или 10 БОЕ на клетку T3A. После инкубации при 37 ° C в течение 20 часов клетки обрабатывали 10 нг / мл TNFα и инкубировали в течение 1 часа.РНК экстрагировали из клеток, и уровни мРНК IκBα относительно контроля GAPDH измеряли с помощью RT-qPCR. Экспрессия IκBα в ложно инфицированных клетках, обработанных агонистом TNFα, была установлена ​​на 100%. Экспрессия гена в каждой реплике, среднее значение и стандартное отклонение показаны **, P <0,01 по t-критерию Стьюдента по сравнению с имитацией инфицированных клеток, трансфицированных vgRNA. (C) Клетки ATCC L929 адсорбировали PBS (фиктивный) или 10 БОЕ / клетку T3A. После инкубации при 37 ° C в течение 24 часов клетки обрабатывали 10 нг / мл TNFα и инкубировали в течение 1 часа.Ядерные экстракты подвергали иммуноблоттингу с использованием антисыворотки, специфичной к p65 или PSTAIR. (D) Клетки ATCC L929 адсорбировали PBS (фиктивный) или 10 БОЕ / клетку T3A. После инкубации при 37 ° C в течение 24 часов клетки обрабатывали 20 мкМ ингибитора протеасом PSI в течение 1 часа, затем 10 нг / мл TNFα в течение 30 минут. Экстракты целых клеток подвергали иммуноблоттингу с использованием антисыворотки, специфичной для фосфорилирования p65, p65 Ser536 и PSTAIR.

Уровни IKKβ и NEMO снижаются после реовирусной инфекции

Чтобы определить основание неактивности IKK после заражения T3A, мы исследовали уровни IKKβ и NEMO, ключевых компонентов IKK, которые необходимы для активации NF-κB после лечения TNFα. Мы обнаружили, что уровни IKKβ и NEMO значительно ниже через 12 и 24 часа после заражения T3A (рис. 4A, 4B). Напротив, уровни предшествующего сигнального белка, RIP1, не были затронуты инфекцией T3A. Точно так же уровни составляющих NF-κB p50 и p65 также оставались постоянными. Эти данные показывают, что T3A-опосредованное снижение уровней IKKβ и NEMO, вероятно, способствует снижению активности IKK и, как результат, блокаде NF-κB в инфицированных клетках. Поскольку IKKβ является каталитическим компонентом комплекса IKK, который необходим для фосфорилирования IκBα и p65 Ser536, мы использовали уровни IKKβ в качестве суррогата для отслеживания механизма, с помощью которого активность IKK снижается после инфекции.

Рис. 4.

Реовирусная инфекция вызывает снижение уровней IKKβ и NEMO. Клетки ATCC L929 адсорбировали PBS (имитация) или 10 БОЕ / клетку T3A. После инкубации при 37 ° C в течение 12 или 24 часов экстракты целых клеток подвергали иммуноблоттингу с использованием антисывороток, специфичных к p50, p65, IKKβ, NEMO, RIP1 и PSTAIR.

Экспрессия гена реовируса необходима для потери IKKβ

Чтобы определить стадию цикла репликации реовируса, которая требуется для потери комплекса IKK и ингибирования NF-κB, мы обработали клетки рибавирином, который уменьшает вирусную экспрессия генов (13, 22).Мы обнаружили, что лечение рибавирином предотвращает опосредованную T3A потерю IKKβ (фиг. 5A). В соответствии с этим в клетках, обработанных рибавирином, T3A больше не был способен предотвращать управляемое TNFα накопление в ядре p65 (фиг. 5B). Кроме того, обработка рибавирином также снижает способность T3A блокировать экспрессию зависимых от NF-κB генов (фиг. 5C). Вместе эти эксперименты показывают, что один или несколько вирусных белков, продуцируемых после вирусной инфекции или определенного события в вирусной репликации, запускают потерю IKKβ.

Рис. 5. Экспрессия гена

реовируса необходима для потери IKKβ. (A) Клетки ATCC L929 адсорбировали PBS (имитация) или 10 БОЕ / клетку T3A в присутствии 0 или 200 мкМ рибавирина. После инкубации при 37 ° ° C в течение 24 часов экстракты целых клеток подвергали иммуноблоттингу с использованием антисыворотки, специфичной для IKKβ, PSTAIR и реовируса. (B) Клетки ATCC L929 адсорбировали с помощью PBS (фиктивный) или 10 БОЕ / клетку T3A в присутствии 0 или 200 мкМ рибавирина. После инкубации при 37 ° C в течение 24 часов клетки обрабатывали 10 нг / мл TNFα и инкубировали в течение 1 часа.Ядерные экстракты подвергали иммуноблоттингу с использованием антисыворотки, специфичной к p65 или PSTAIR. (C) Клетки ATCC L929 адсорбировали PBS (имитация) или 10 БОЕ / клетку T3A в присутствии 0 или 200 мкМ рибавирина. После инкубации при 37 ° C в течение 24 часов клетки обрабатывали 10 нг / мл TNFα и инкубировали в течение 1 часа. РНК экстрагировали из клеток, и экспрессию гена IκBα измеряли с помощью RT-qPCR. Экспрессия гена в ложно инфицированных клетках, обработанных TNFα, была установлена ​​на 100%. Показаны экспрессия генов в каждой реплике, среднее значение и стандартное отклонение. *, P <0,05 по t-критерию Стьюдента по сравнению с имитацией инфицированных клеток, обработанных TNFα. NS, не имеет значения по сравнению с ложно инфицированными клетками, обработанными TNFα.

Сверхэкспрессия IKK восстанавливает передачу сигналов NF-κB в клетках, инфицированных реовирусом

Чтобы определить, происходит ли блокада NF-κB с помощью T3A также в других линиях клеток, мы измерили способность T3A влиять на индуцированную TNFα экспрессию IκBα в клетках HEK293 с использованием RT -qPCR. Аналогично нашему наблюдению на клетках L929, TNFα не смог индуцировать экспрессию гена IκBα в клетках HEK293, инфицированных T3A (рис.6А). Фосфорилирование p65 по Ser536 (фиг. 6B) и его ядерная транслокация после обработки TNFα также ингибировались (фиг. 6C). Кроме того, мы отметили снижение уровней IKKβ по сравнению с ложно инфицированными клетками (фиг. 6B). Чтобы определить, восстанавливает ли эктопическая сверхэкспрессия комплекса IKK передачу сигналов NF-κB в клетках, инфицированных реовирусом, мы трансфицировали клетки конструкциями, экспрессирующими меченые формы IKKβ и NEMO. Сверхэкспрессии этих конструкций было достаточно для индукции передачи сигналов NF-κB в ложно инфицированных клетках, что отмечено фосфорилированием p65 Ser536 (рис.6D). Мы обнаружили, что при инфицировании клеток T3A не наблюдалось снижения уровней IKKβ. Соответственно, индуцированное сверхэкспрессией IKK фосфорилирование p65 не затрагивалось реовирусной инфекцией. Эти данные дополнительно указывают на связь между уровнями IKKβ и активностью NF-κB в клетках, инфицированных реовирусом. Таким образом, мы заключаем, что снижение уровней IKKβ и NEMO является ключевым механизмом индуцированной реовирусом блокады передачи сигналов NF-κB.

Рис. 6. Сверхэкспрессия

IKK преодолевает опосредованную реовирусом блокаду передачи сигналов NF-κB.(A) Клетки HEK293 адсорбировали PBS (фиктивный) или 10 БОЕ / клетку T3A. После инкубации при 37 ° C в течение 24 часов клетки обрабатывали 10 нг / мл TNFα и инкубировали в течение 1 часа. РНК экстрагировали из клеток, и экспрессию гена IκBα измеряли с помощью RT-qPCR. Экспрессия гена в ложно инфицированных клетках, обработанных TNFα, была установлена ​​на 100%. Показаны экспрессия генов в каждой реплике, среднее значение и стандартное отклонение. *, P <0,05 по t-критерию Стьюдента по сравнению с имитацией инфицированных клеток, обработанных TNFα. (B) Клетки HEK293 адсорбировали PBS (фиктивный) или 10 БОЕ / клетку T3A.После инкубации при 37 ° C в течение 24 часов клетки обрабатывали ингибитором протеасом PSI в течение 1 часа, затем 10 нг / мл TNFα в течение 30 минут. Экстракты целых клеток подвергали иммуноблоттингу с использованием антисыворотки, специфичной для IKKβ, фосфорилирования p65 Ser536, p65 и PSTAIR. (C) Клетки HEK293 адсорбировали PBS (фиктивный) или 10 БОЕ / клетку T3A. После инкубации при 37 ° C в течение 24 часов клетки обрабатывали 10 нг / мл TNFα и инкубировали в течение 1 часа. Ядерные экстракты подвергали иммуноблоттингу с использованием антисыворотки, специфичной к p65 или PSTAIR. (D) Клетки HEK293 трансфицировали векторами, экспрессирующими Flag-tagged IKKβ и NEMO. После инкубации при 37 ° C в течение 24 ч клетки HEK293 адсорбировали PBS (фиктивный) или 10 БОЕ / клетку T3A. После дополнительной инкубации при 37 ° C в течение 24 часов экстракты целых клеток подвергали иммуноблоттингу с использованием антисыворотки, специфичной для FLAG, p65, фосфорилирования p65 Ser536, реовируса и PSTAIR.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы стремились оценить, влияет ли реовирусная инфекция на клеточный ответ на инвазию патогенов. Используя RNA-seq, который позволил нам изучить изменения глобального транскрипционного ландшафта, мы обнаружили, что гены-мишени IRF индуцировались в аналогичной степени в клетках, инфицированных реовирусом, и клетках, трансфицированных vgRNA.Гены-мишени NF-κB, однако, экспрессируются в гораздо меньшей степени в инфицированных клетках по сравнению с клетками, трансфицированными vgRNA. Более того, экзогенные агонисты NF-κB не смогли вызвать программу экспрессии зависимых от NF-κB генов в инфицированных клетках. Эти данные указывают на то, что активность NF-κB блокируется в инфицированных клетках. Мы обнаружили, что эта блокада экспрессии зависимых от NF-κB генов вызвана потерей IKKβ и NEMO, двух критических компонентов комплекса IKK. Мы предполагаем, что реовирус ингибирует NF-κB, чтобы противостоять его противовирусным эффектам и создавать клеточную среду, способствующую репликации.

Мы показываем здесь, что реовирусная инфекция ингибирует передачу сигналов NF-κB (рис. 1, 2, 3). Напротив, предыдущие исследования демонстрируют, что реовирусная инфекция приводит к активации NF-κB (23). В то время как каноническая передача сигналов NF-κB требует IKKβ и NEMO, активация NF-κB, индуцированная реовирусом, требует необычной комбинации IKKα и NEMO (24). Активация NF-κB, вызванная реовирусом, происходит на ранней стадии после заражения. Недавние исследования, демонстрирующие потребность в митохондриальном противовирусном сигнальном белке (MAVS) для активации NF-κB, показывают, что vgRNA инициирует этот ответ (17).В то время как другие работы предполагают роль белков реовируса μ1 и μ2 в активации NF-κB, неясно, происходит ли этот эффект за счет контроля воздействия vgRNA или посредством другого механизма (25–27). Несмотря на это, активация NF-κB на ранней стадии инфекции не требует экспрессии вирусных генов. Напротив, наши исследования, представленные здесь, показывают, что экспрессия вирусных генов необходима для блокады NF-κB (рис. 5). Таким образом, обнаружение вирусной РНК активирует NF-κB на ранней стадии инфицирования, а экспрессия одного или нескольких продуктов вирусных генов после установления инфекции приводит к блокаде NF-κB, ограничивая дальнейшую передачу сигналов через этот путь.Также ранее предлагалось двухфазное регулирование NF-κB (21, 28). Наша работа, представленная здесь, дает объяснение этому явлению. Специфическая для серотипа способность реовируса ингибировать NF-κB генетически связана с сегментом генома, кодирующим белок прикрепления реовируса σ1 (28). Поскольку свойства σ1 влияют на эффективность инфекции и уровень экспрессии вирусных генов (29), мы считаем, что генетическая связь между σ1 и NF-κB является непрямой, а вирусный фактор, ответственный за снижение уровней IKK и блокировку передачи сигналов NF-κB. остается неизвестным.

NF-κB - эффективный провоспалительный сигнальный путь, сдерживающий инфекцию. Поэтому патогены выработали механизмы, ограничивающие его активность. Заражение коронавирусом человека вызывает потерю как IKKβ, так и NEMO по неизвестному механизму (30). Белок M45 MCMV нацелен на NEMO для аутофаголизосомальной деградации (31). Shigella, внутриклеточные патогенные бактерии, секретируют эффектор с активностью E3-лигазы, который нацелен на NEMO для протеасомной деградации (32). Помимо деградации, патогены также изолируют комплекс IKK (белок IAV NS1) или предотвращают его активацию (HCMV, энтеровирус) (33–35).Здесь мы показываем, что реовирусная инфекция приводит к потере как IKKβ, так и NEMO (рис. 4). Эта потеря не была связана с различиями в устойчивых уровнях мРНК IKKβ в клетках, инфицированных реовирусом (не показано). Это также не зависело от эффекта реовирусной инфекции на трансляцию хозяина, что позволяет предположить, что уровни IKKβ контролировались посттрансляционно (не показано). Реовирус не кодирует протеазу, что исключает прямое действие вирусной протеазы на IKKβ. Предотвращение кислотно-зависимой протеазной активности также не приводило к восстановлению уровней IKKβ, что указывает на то, что лизосомная или аутофагическая деградация не способствует потере IKK (не показано).Таким образом, наша работа контрастирует с предыдущим исследованием, которое предположило, что TRIM29 в альвеолярных макрофагах превращает NEMO через лизосомную деградацию (36). Блокада активности протеасомы уменьшала реовирусную инфекцию, не позволяя нам оценить роль протеасомы в потере IKKβ после инфицирования (не показано). Таким образом, реовирусная инфекция приводит к потере IKK по посттрансляционному механизму, вероятно, к деградации по нелизосомному пути.

Каково физиологическое значение блокады реовируса сигнального пути NF-κB? Вероятная причина в том, что NF-κB может ограничивать репликацию вируса.Какая мишень (-и) NF-κB контролирует вирусную инфекцию, не идентифицировано. Очевидной мишенью NF-κB, которая может ингибировать реовирусную инфекцию, является IFN. Однако в соответствии с предыдущей работой, предполагающей, что определенные типы клеток мыши не нуждаются в NF-κB для продукции IFN (37, 38), мы обнаружили в наших анализах RNA-seq, что ингибирование NF-κB не влияет на продукцию IFN (рис. ). Таким образом, противовирусный эффект NF-κB не зависит от IFN. В отличие от IFN, мы обнаружили, что экспрессия некоторых других хемокинов и цитокинов ингибируется в инфицированных реовирусом клетках.Мы предполагаем, что один или несколько из этих факторов негативно регулируют репликацию реовируса.

Два предыдущих исследования показали, что реовирус ограничивает врожденный иммунный ответ. Реовирус может ингибировать выработку IFN, секвестрируя IRF3 в вирусные фабрики (39). Кроме того, реовирус может ингибировать передачу сигналов IFN за счет секвестрации ядра IRF9, который функционирует с STAT1 и 2, способствуя экспрессии генов, стимулированных IFN (40). Хотя наша работа не проверяла эти идеи напрямую, наши анализы экспрессии генов показывают, что реовирус не подавляет функцию IRF3 (рис. 1). Мы также не наблюдаем ингибирования транскрипционного комплекса, содержащего IRF9 (не показан). Поскольку эти предыдущие исследования проводились на разных типах клеток и использовали разные штаммы реовируса, мы предполагаем, что реовирус развил несколько механизмов, чтобы ослабить врожденный иммунный ответ. Наше исследование, представленное здесь, раскрывает один из таких механизмов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки и вирусы

Мышиные клетки L929 (ATCC CCL-1) поддерживали в минимальной необходимой среде Игла (MEM) (Lonza) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 2 мМ L-глутамина. .Клетки L929, адаптированные к спиннеру (полученные из лаборатории Т. Дермоди), поддерживали в MEM Joklik (Lonza) с добавлением 5% FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 25 мкг / мл стрептомицина. нг / мл амфотерицина B. Клетки HEK293 (полученные из лаборатории М. Маркетона) поддерживали в модифицированной эссенциальной среде Дульбекко (DMEM) (Lonza) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 2 мМ L-глутамина. Клетки L929, адаптированные к спиннеру, использовали для культивирования и очистки вирусов и для анализа бляшек.Клетки ATCC L929 и клетки HEK293 использовали во всех экспериментах для оценки клеточной передачи сигналов. Не наблюдалось различий в проницаемости между клетками ATCC L929 и клетками L929, адаптированными к спиннеру. Лабораторный запас Т3А (полученный из лаборатории Т. Дермоди) использовали для лечения инфекций. Инфекционные вирусные частицы очищали экстракцией Vertrel XF и центрифугированием в градиенте CsCl (41). Титр вируса определяли с помощью анализа бляшек с использованием адаптированных к спиннеру клеток L929 с химотрипсином в покрытии агара.

Антитела и реагенты

Поликлональные антисыворотки против T3D, T1L, которые были описаны (42), использовались для обнаружения вирусных белков в клетках, инфицированных T3A. Кроличьи антисыворотки, специфичные к IKKβ и антителу, специфичному к фосфорилированию p65 Ser536, были приобретены в Cell Signaling (каталог № 8943, 3033), кроличьи антисыворотки, специфичные к p65 и NEMO, были приобретены в Santa Cruz Biotechnology (каталог № sc-372, sc-8330). Мышиные антисыворотки, специфичные для PSTAIR и FLAG, были приобретены у Sigma-Aldrich (каталог № P7962, F-3165), мышиные антисыворотки, специфичные для RIP1, были приобретены у BD Biosciences (каталог № 610458), конъюгированные с Alexa Fluor антимышиные IgG и антикроличьи Вторичные антитела IgG были приобретены у LI-COR.TNFα был приобретен у Sigma и использовался в концентрации 10 нг / мл. Ингибитор протеасомы PSI был приобретен у Millipore и использовался в концентрации 20 мкМ (№ по каталогу 53-916). Рибавирин был приобретен у Sigma-Aldrich и использовался в концентрации 200 мкМ (номер по каталогу R9644)

Инфекции

Конфлюэнтные монослои клеток ATCC L929 или HEK293 адсорбировались либо PBS, либо реовирусом при указанной MOI при комнатной температуре в течение 1 часа. с последующей инкубацией со средой при 37 ° C в течение указанного интервала времени.Все ингибиторы добавляли к клеткам в среде после периода адсорбции в течение 1 часа.

Анализ экспрессии гена-хозяина с помощью RNA-seq

Суммарная РНК, экстрагированная с помощью мини-набора Aurum Total RNA (Bio-Rad), была отправлена ​​в Центр геномики и биоинформатики Университета Индианы для создания библиотеки кДНК с использованием набора для приготовления образцов многожильной мРНК TruSeq LT. (Illumina) в соответствии с протоколом производителя. Секвенирование выполняли с использованием платформы Illumina NextSeq500 с модулем секвенирования 75 п.о., генерирующим чтения с парных концов 38 п.о.После запуска секвенирования демультиплексирование выполняется с помощью bcl2fastq v2.20.0.422. Последовательные чтения были обрезаны адаптером и отфильтрованы по качеству с помощью Trimmomatic ver. 0,33 (43) с порогом отсечения для средней базовой оценки качества, установленной на уровне 20 в скользящем окне из 3 баз. Считывания короче 20 оснований после обрезки были исключены (LEADING: 20 TRAILING: 20 SLIDINGWINDOW: 3: 20 MINLEN: 20). Очищенные чтения сопоставлены со ссылкой на геном мыши GRCm38.p6 с использованием версии STAR STAR_2.5.2b (44). Пары считывания, выравнивающиеся с каждым геном из аннотации gencode vM17, подсчитывались со специфичностью цепи с использованием инструмента featureCounts из пакета subread (45).Анализ дифференциальной экспрессии был выполнен с использованием DESeq2 версии 1. 12.3 (46).

iRegulon, плагин для cytoscape версии 3.7.1, использовался для прогнозирования активности фактора транскрипции на основе дифференциально экспрессируемого набора генов (18). Максимальное значение FDR сходства мотивов было установлено на 0,001. Мы использовали значение NES 3,0 в качестве минимального порога обогащения фактора транскрипции. Δ NES рассчитывали следующим образом: (NES для vgRNA> Mock) - (NES для экспериментальных условий).

RT-qPCR

РНК

экстрагировали из инфицированных клеток в разное время после заражения с использованием мини-набора Aurum Total RNA Mini (Bio-Rad).Для RT-qPCR от 0,5 до 2 мкг РНК подвергали обратной транскрипции с помощью набора для RT cDNA высокой емкости (Applied Biosystems) с использованием случайных гексамеров. кДНК подвергали ПЦР с использованием SYBR Select Master Mix с использованием специфичных для генов праймеров (Applied Biosystems). Кратное увеличение экспрессии генов по сравнению с контрольными образцами (указано в легенде каждого рисунка) измеряли с использованием метода ΔΔ C T (47). Расчеты для определения значений ΔΔ C T и относительных уровней экспрессии генов выполняли следующим образом: кратное увеличение экспрессии клеточных генов (относительно уровней глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы [GAPDH]) = 2 - [ (IκBα CT - GAPDH CT ) TNFα - (представляющий интерес ген CT - GAPDH CT контроль)

Приготовление клеточных экстрактов

Для приготовления лизатов цельноклеточных клеток клетки промывали фосфатом. забуференный физиологический раствор (PBS) и лизированный 1 × RIPA (50 мМ Трис [pH 7.5], 50 мМ NaCl, 1% TX-100, 1% дезоксихолата, 0,1% SDS и 1 мМ EDTA), содержащий коктейль ингибиторов протеаз (Roche), 500 мкМ дитиотреитол (DTT) и 500 мкМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF) с последующим центрифугированием при 15000 × г при 4 ° C в течение 15 минут для удаления мусора. Ядерные экстракты готовили путем лизирования клеток в буфере для гипотонического лизиса (10 мМ HEPES, 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl, 0,5 мМ DTT и 0,5 мМ PMSF в течение 15 минут с последующим добавлением 0,5% NP-40 и 10 секунд раствора. встряхивание.После центрифугирования при 10000 × g при 4 ° C в течение 10 мин осадок ядер промывали буфером для гипотонического лизиса, а затем ресуспендировали в высокосолевом буфере для экстракции ядер (25% глицерин, 20 мМ HEPE, 0,42 М NaCl, 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl, 0,5 мМ DTT, 0,5 мМ PMSF) при 4 ° C в течение 1 часа. Ядерные экстракты получали после удаления нерастворимой фракции центрифугированием при 12000 × g при 4 ° C в течение 10 мин.

Плазмидные трансфекции

Почти конфлюэнтные монослои клеток HEK293 в 12-луночных планшетах трансфицировали либо 0.5 мкг пустого вектора или по 0,25 мкг каждого экспрессионного вектора FLAG-IKKβ или FLAG-NEMO с использованием 1,5 мкл Lipofectamine 2000 в соответствии с инструкциями производителя. Трансфицированные клетки инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов до инфицирования, чтобы обеспечить экспрессию плазмид.

Иммуноблоттинг

Концентрации белка оценивали с помощью анализа белка DC от Bio-Rad. Загружали равный белок, и лизаты или экстракты клеток разделяли электрофорезом в 10% полиакриламидных гелях и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Мембраны блокировали не менее 1 ч в блокирующем буфере (блокирующий буфер StartingBlock T20 TBS) и инкубировали с антисывороткой против p65 (1: 1000), p65 p-Ser536 (1: 1000), p50 (1: 500), NEMO (1). : 500), IKKβ (1: 1000), RIP1 (1: 1000), реовирус (1: 5000), FLAG (1: 1000) и PSTAIR (1: 5000) при 4 ° C в течение ночи. Мембраны промывали трижды по 5 мин каждый промывочным буфером (забуференный трис-солевым раствором [TBS], содержащий 0,1% твин-20) и инкубировали с разведением 1: 20000 козьего антикроличьего Ig, конъюгированного с Alexa Fluor (для p65, p50 , IKKβ, NEMO и реовирус) или козьего антимышиного Ig (для PSTAIR, RIP1 и FLAG) в блокирующем буфере.После трех промывок мембраны сканировали и количественно определяли с использованием инфракрасного тепловизора Odyssey (LI-COR).

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим сотрудников нашей лаборатории и вирусологическое сообщество Университета Индианы за полезные предложения. Мы также признательны ученым Центра геномики и биоинформатики Университета Индианы.

Исследование, представленное в этой публикации, было поддержано фондами Национального института аллергии и инфекционных заболеваний под номером R01AI110637 (П.D.), а также на средства Института клинических и трансляционных наук Индианы под номером UL1TR002529 от Национального института здравоохранения, Национального центра развития трансляционных наук, награды за клинические и трансляционные науки. Авторы полностью несут ответственность за содержание и не обязательно отражают официальную точку зрения спонсоров.

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку "Назад" и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или уточнить у системного администратора.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Новый перекрестный разговор внутри семейства IKK контролирует врожденный иммунитет | Biochemical Journal

Члены семейства IKK {IκB [ингибитор NF-κB (ядерный фактор κB)] киназы} играют центральную роль в врожденном иммунитете, индуцируя NF-κB- и IRF [фактор регуляции IFN (интерферона)] -зависимые программы транскрипции генов, необходимые для продукции провоспалительных цитокинов и IFN. Однако молекулярные механизмы, которые активируют эти протеинкиназы и их набор физиологических субстратов, остаются плохо определенными. Используя MRT67307, новый ингибитор IKKϵ / TBK1 (TANK {TRAF [TNF (фактор некроза опухоли) -рецептор-связанный фактор] -ассоциированный активатор NF-κB} -связывающей киназы 1) и BI605906, новый ингибитор IKKβ, мы демонстрируем, что два разных сигнальных пути участвуют в активации IKK-связанных протеинкиназ лигандами, которые активируют рецепторы IL-1 (интерлейкин-1), TLR (Toll-подобный рецептор) 3 и TLR4.Один путь передачи сигналов опосредуется каноническими IKK, которые непосредственно фосфорилируют и активируют IKKϵ и TBK1, тогда как второй путь, по-видимому, завершается автокаталитической активацией IKK-родственных киназ. Напротив, TNFα-индуцированная активация IKK-родственных киназ опосредуется исключительно каноническими IKK. В свою очередь, IKK-родственные киназы фосфорилируют каталитические субъединицы канонических IKK и их регуляторную субъединицу NEMO (эссенциальный модулятор NF-κB), что связано со сниженной активностью IKKα / β и NF-κB-зависимой транскрипцией гена. Мы также показываем, что канонические IKK и родственные IKK киназы не только имеют уникальные физиологические субстраты, такие как IκBα, p105, RelA (IKKα и IKKβ) и IRF3 (IKKϵ и TBK1), но также имеют несколько общих субстратов, включая каталитические и регуляторные (NEMO и TANK) субъединицы самих IKK. Взятые вместе, наши исследования показывают, что канонические IKK и IKK-родственные киназы регулируют друг друга с помощью сложной сети, включающей фосфорилирование их каталитических и регуляторных (NEMO и TANK) субъединиц, чтобы сбалансировать их активность во время врожденного иммунитета.

Количественная характеристика и анализ динамического ответа NF-κB в микроглии | BMC Bioinformatics

TNFα стимулирует динамическую активацию NF-κB и IKK в микроглии BV2

Чтобы охарактеризовать динамику канонической активации NF-κB в микроглии, клетки из линии микроглиальных клеток BV2 культивировали и обрабатывали 10 нг / мл TNFα. Экстракты целых клеток собирали в трех экземплярах в течение периода времени после стимуляции в пяти идентичных экспериментах, проводимых в разные дни. Измерения с помощью ELISA ДНК-связывающей активности NF-κB p65 показывают, что активация NF-κB в микроглии BV2 сильно индуцируется TNFα (рис. 2A). Через пять минут после обработки TNFα активация NF-κB остается близкой к базовым уровням, но после этого быстро увеличивается, достигая максимальной активности около 20 минут. После начального пика активность NF-κB снижается примерно до 90 мин, когда она возвращается ко второму пику меньшей амплитуды. Двухфазный профиль активности NF-κB в микроглии BV2 согласуется с ответом NF-κB на устойчивую стимуляцию TNFα, наблюдаемую по измерениям уровня популяции во многих других типах клеток [19].

Рисунок 2

Динамика активации NF-κB и IKK в микроглии BV2, обработанной TNFα . Измерения с помощью ELISA (A) активности связывания ДНК NF-κB p65 и (B) активности киназы IKKβ после непрерывной стимуляции 10 нг / мл TNFα. Маркеры данных в каждый момент времени представляют собой средние выборки из независимых экспериментов, проведенных в отдельные дни. Планки погрешностей указывают на одно стандартное отклонение образцов.

Чтобы лучше охарактеризовать воспалительную реакцию в микроглии, мы дополнительно экспериментально исследовали активацию вышестоящей киназы IκB (IKK).Динамику активности IKK измеряли в течение первых 30 минут после обработки 10 нг / мл TNFα в трех идентичных экспериментах. ИКК быстро активируется, достигая пикового уровня около 5 мин. К 10 минутам активность IKK резко падает до уровня ниже половины максимального и постепенно снижается до почти базального уровня в течение следующих 20 минут (Рисунок 2B). Этот временный профиль напоминает активацию IKK, характерную для ответа в большинстве других типов клеток на высокие дозы TNFα, при котором активность IKK достигает пика между 5-15 мин и падает ниже 25% от своего максимального значения к 30 мин [20, 21].Однако быстрое снижение активности с максимальной активности через 5 минут до ~ 33% активности через 10 минут особенно заметно в микроглии.

Промежуточные этапы в пути IKK-индуцированной деградации IκBα согласовывают математическую модель с активацией NF-κB в микроглии.

Затем мы попытались количественно описать активацию NF-κB микроглии с помощью математической модели. Хотя в последние годы был опубликован ряд математических моделей для NF-κB (обзор приведен в [19]), мы предпочли начать с простого описания, которое все еще отражает основные компоненты сети.Для этой цели мы выбрали детерминированную структуру модели обыкновенного дифференциального уравнения (ОДУ), недавно опубликованную Ашаллом и др. [14], которая была основана главным образом на более ранней модели Липняцки и др. [18]. Эта модель включает в себя основную архитектуру канонического сигнального пути и способна предсказать многие ключевые особенности активации NF-κB в разных типах клеток в различных условиях.

Мы сначала попытались идентифицировать параметры для существующей модельной структуры, чтобы соответствовать экспериментальным профилям активации NF-κB и IKK микроглии.Алгоритм оценки параметров на основе оптимизации был запущен с использованием многих случайно выбранных значений параметров из пространства параметров в качестве начальных предположений. Однако не было обнаружено наборов параметров, которые соответствовали бы активности микроглии IKK и NF-κB. В частности, модель не смогла качественно воспроизвести быструю индукцию и ослабление активности IKK, наблюдаемую в микроглии для любого из тестируемых наборов параметров, и предполагалось, что активация NF-κB будет происходить быстрее, чем 5-минутная задержка, наблюдаемая на рисунке 2A.Несоответствия между моделью и данными побудили нас исследовать временной интервал сразу после стимула TNFα.

Анализы чувствительности были выполнены на модели для количественной оценки относительного вклада каждого из параметров системы в концентрацию свободного NF-κB в течение первых 10 минут, учитывая большие несоответствия между моделью и данными в этом интервале. Только семь из 26 исходных параметров системы оказывают заметное влияние на активность NF-κB в течение этого времени на основе их усредненных по времени оценок чувствительности (рисунок 3A, дополнительный файл 1: рисунок S1).Примечательно, что наиболее значимые параметры включают скорости, регулирующие активность IKK, IKK-индуцированное фосфорилирование и деградацию связанного IκBα, ядерный импорт NF-κB и его ассоциацию с IκBα, а также соотношение между объемами цитоплазмы и ядра. Никакие параметры, управляющие регуляцией транскрипции или другими нижестоящими процессами, не оказывают значительного влияния на активацию NF-κB в течение этого раннего временного интервала, о чем свидетельствует их очень низкая оценка чувствительности. Более того, это исключало возможность того, что обратная связь от других изоформ IκB (например,грамм. IκBε), не включенные в эту модель, могут быть добавлены для учета расхождений в динамике. Это позволило предположить, что кратковременная задержка в инициации активации NF-κB, наблюдаемая в микроглии, вероятно, была связана с немоделированной динамикой, участвующей в IKK-зависимой деградации IκBα, или с динамикой восходящего сигнального пути, управляющего активацией IKK, что позволяет нам ограничивать нашу первоначальную внимание только к подмножеству ключевых параметров восходящего потока.

Рисунок 3

Новая модельная структура, необходимая для характеристики активации NF-κB в микроглии . (A) Активность NF-κB в течение первых 10 минут после стимуляции была высокочувствительной только к семи из 26 параметров скорости. (B) Используя сигнал IKK, полученный в результате экспериментальных измерений, в качестве входных данных для модели, внешний контур обратной связи может быть удален (обозначен серыми линиями), изолируя нижестоящий модуль активации NF-κB с помощью обратной связи IκBα. Точно так же, как только концентрация ядерного NF-κB известна, этот сигнал можно использовать для управления восходящей сетью активации IKK независимо от нижестоящего модуля.(C) Структура модели из исходной модели (вверху) и новой модели (внизу). (D) Моделирование с параметрами, оцененными для существующей модели (пунктирная линия) и новой модели (сплошная линия) с использованием экспериментальной кривой IKK в качестве входных данных. На вставке представлен подробный вид посадки модели на начальном этапе активации. (E) Результаты 1980 случайно инициализированных оценок параметров для каждой модели были проверены на статистическую согласованность с данными с использованием метода Фишера (см. Методы) и разделены на интервалы в соответствии с p-значением.Ни один из оцененных наборов параметров с исходной моделью не достиг P-значения> 10 -7 (красный), в то время как почти половина оцененных наборов параметров с новой моделью (синий) имела P> 0,01.

Чтобы упростить исследование этих возможностей и облегчить разработку модели, мы сначала рассмотрели нижележащую сеть независимо от восходящей сети активации IKK. IKK взаимодействует с нижележащим модулем только посредством ферментативного фосфорилирования IκBα и посредством ингибирования по обратной связи от A20 (Рисунок 3B).Мы изолировали нисходящую сеть, разорвав внешний контур обратной связи A20 и используя интерполированные экспериментальные данные активации IKK в качестве входных данных для модели способом, напоминающим предыдущие работы других [22].

При фиксированном профиле IKK в качестве входных данных для модели была повторена процедура оценки параметров методом наименьших квадратов с определенными значениями параметров и биологическими характеристиками, ограниченными литературой (дополнительный файл 1: таблица S2). Моделирование существующей нижестоящей модели с оцененными параметрами предсказало, что уровни свободного NF-κB увеличиваются раньше, чем то, что было обнаружено в микроглии, как и в случае с полной моделью (Рисунок 3D).Чтобы проверить, ограничен ли этот результат конкретным набором значений или удерживается в более общем плане, было получено множество дополнительных оценок, начиная с начальных значений, случайно выбранных из пространства параметров, с использованием как целевой функции наименьших квадратов, так и альтернативной целевой функции, адаптированной на основе параметра. метод оценки, предложенный в [23]. Следуя методике, описанной в [23], мы применили апостериорный статистический тест , основанный на методе Фишера, чтобы проверить, соответствуют ли моделирование для каждого набора оцененных параметров экспериментальным данным с учетом ошибок измерения в данных (см. Методы). .Результаты показали, что с исходной структурой модели 100% оцененных наборов параметров имели P-значения <10 -7 (рис. 3E), что привело нас к выводу, что исходная модель не могла обеспечить динамику, совместимую с данными.

Вместе с результатами чувствительности, показывающими, что очень немногие системные параметры существенно влияют на активацию NF-κB в течение первых 10 минут активации, это убедительно свидетельствует о вероятной немоделированной динамике в пути IKK-индуцированной деградации IκBα.Затем мы исследовали, можно ли модифицировать модель биологически значимым образом, чтобы учесть отсутствующую динамику и лучше соответствовать данным.

Исходная модельная структура описывает IKK-зависимую деградацию IκBα в два этапа: фосфорилирование IκBα, катализируемое IKK, и деградация фосфорилированного IκBα (Рисунок 3C). Однако это двухэтапное описание опускает многие промежуточные стадии, которые происходят до деградации IκB протеасомой 26S [7]. Поэтому мы расширили модель, включив в нее две промежуточные реакции после фосфорилирования IκBα и предшествующей деградации IκBα, которые, как мы полагаем, могут быть достаточными для объяснения отсутствующей динамики. Реакции примерно соответствуют распознаванию фосфорилированного IκBα промежуточным звеном лигазы E3 и присоединению цепи убиквитина (Ub) к субстрату (рис. 3C). Следует отметить, что каждая из этих реакций потенциально включает множество промежуточных стадий и может не соответствовать непосредственно реакциям, как они описаны здесь; однако механистические детали этого пути, полученные из литературы, обеспечивают биологическую основу для разработки этой модели.

При наличии новой структуры модели параметры, соответствующие новым реакциям разложения IκBα, вызванным стимулом, были оценены с использованием алгоритма оптимизации, при этом все остальные параметры после деградации IκBα были зафиксированы на их ранее оцененных значениях.Примечательно, что параметры, как было обнаружено, близко соответствовали активации NF-κB микроглии, уменьшая ошибку подбора данных почти на 67%, с более чем 9-кратным улучшением, в частности, в течение первых 20 минут (дополнительный файл 1: рисунок S2). Повторная оценка других параметров с помощью модифицированной модели обеспечила еще лучшее согласие с данными, дополнительно уменьшив ошибку аппроксимации с 0,67 до 0,30 (рис. 3D). Согласованность между симуляциями новой модели и данными оценивалась с использованием апостериорного статистического теста , как и раньше.При этих параметрах тест дал P-значение 0,038, что означает, что нулевая гипотеза не может быть отклонена с высоким уровнем значимости. Этот результат был подтвержден получением большого количества оценок параметров и обнаружением, что почти 50% оценок с этой структурой модели имели P> 0,01 (рис. 3E).

Эти результаты являются убедительным доказательством того, что добавление динамики, примерно соответствующей стадиям, включающим распознавание и связывание фосфорилированного IκBα лигазой E3, полиубиквитинирование и протеасомную деградацию, достаточно для объяснения слегка отсроченной активации NF-κB, наблюдаемой в микроглии.

Нелинейность активации и инактивации IKK вызывает быструю временную активность IKK в микроглии.

Далее мы сосредоточили наше внимание на вышестоящем сигнальном пути, управляющем активацией IKK в ответ на стимуляцию TNFα. Модуль передачи сигналов выше по потоку был отделен от модели ниже по потоку с помощью концентрации свободного ядерного NF-κB, продуцируемого нижележащим модулем в качестве входных данных фиксированной модели (рис. 3B). Это позволило нам рассмотреть только реакции, непосредственно управляющие активностью IKK и ее регулирование с помощью A20, что снова значительно упростило задачу разработки модели.

Первоначальная восходящая модель [14], которая включает циклическое переключение IKK между тремя состояниями (нативным, активным и неактивным) и обратную связь от A20, была неспособна адекватно соответствовать быстрой активации или деактивации активации микроглии (Figure 4B). Поэтому мы изучили способы, которыми модель может быть изменена в соответствии с биологией, чтобы лучше соответствовать данным.

Рисунок 4

Разработка восходящей модели и полной модели для . (A) Модель выше по течению с ингибированием A20 в двух точках была модифицирована, чтобы включить нелинейные скорости активации и инактивации IKK, указанные пунктирными линиями.(B) Моделирование с помощью недавно разработанной модели восходящего потока (сплошная линия) обеспечило отличное согласие с моделью (P = 0,854, SSE = 0,038), намного лучше, чем то, что было возможно с существующей структурой модели (пунктирная линия) (P = 0,0002, SSE = 0,661). Благодаря недавно разработанным модулям восходящего и нисходящего потока, интегрированным в полную модель, новые оценки параметров смогли соответствовать активности как NF-κB (C), так и IKK (D) в микроглии. (E) Прогнозы модели для общего количества IκBα (сплошная линия) сравниваются с экспериментальными измерениями общего белка IκBα в BV2-клетках после обработки 10 нг / мл TNFα.

Активация комплекса IKK на биомолекулярном уровне включает набор и сборку сигнального комплекса после связывания TNFα с его рецептором, а также многочисленные посттрансляционные модификации субъединиц комплекса до того, как IKK активируется фосфорилированием по двум остаткам в его киназный домен [7]. Хотя другие исследования пытались смоделировать восходящий путь на более высоком уровне детализации [24–26], многие детали все еще решаются, и мы решили сохранить базовое описание цикла IKK из [14].Скорость реакции активации была изменена с линейной функции на нелинейное уравнение Хилла в качестве грубого приближения ко многим промежуточным этапам, участвующим в активации IKK.

Быстрое ослабление активности IKK после ее индукции важно для правильной передачи сигналов и результирующей двухфазной активности NF-κB [20, 27]. Сообщается, что IKK подвергается гиперфосфорилированию по 9 или 10 остаткам на С-конце, что, как было обнаружено, значительно снижает активность киназы в клетках [27]. Мы предположили, что потенциальная кооперативность в инактивации IKK из-за аутофосфорилирования может привести к нелинейности в уравнении скорости инактивации модели.Соответственно, линейная скорость реакции была изменена на нелинейное уравнение Хилла.

Обратная связь от A20 в опубликованной модели была предложена для ингибирования перехода инактивированного IKK обратно в его нативное состояние [14]. Поскольку мы не знали о какой-либо биологической основе такого механизма, мы приняли два механизма взаимодействия A20 (рис. 4A), которые были идентифицированы в литературе и также были включены в предыдущие модели. Первый - это прямая инактивация комплекса IKK белком A20, механизм, описанный в [28, 29] и ранее смоделированный в [18].В нашей модели мы использовали идентичное математическое описание этого взаимодействия из [18]. Во-вторых, известно, что A20 ингибирует активацию опосредованно посредством своей убиквитин-редактирующей активности вышележащих сигнальных компонентов [13]. Этот механизм был включен в предыдущие модели, которые имеют более подробное описание восходящего сигнального пути [25, 26]. Мы адаптировали это второе взаимодействие к нашей модели, предположив, что A20 ослабляет скорость TNF-индуцированной активации IKK в зависимости от концентрации.

Оценка параметров была выполнена с использованием недавно разработанной восходящей модели с фиксированным ядерным NF-κB в качестве входных данных. Были найдены параметры, для которых модель показала отличное согласие с активацией микроглиальной IKK (рис. 4В), уменьшая ошибку подгонки более чем на порядок по сравнению с наилучшим соответствием, достигнутым с исходной вышестоящей моделью (ошибка 0,04 по сравнению с 0,66). Согласованность прогнозов с использованием новой восходящей модели с данными IKK более статистически значима (P = 0.85 по сравнению с P = 0,0002), чем с исходной структурой модели из [14]. Примечательно, что мы наблюдали, что наилучшее соответствие с новой моделью было достигнуто с высокими коэффициентами Хилла (> 3) для инактивации IKK, что свидетельствует о высоко кооперативном механизме основного биологического процесса (дополнительный файл 1: Рисунок S3).

Недавно разработанные восходящие и нисходящие сигнальные модули были интегрированы, чтобы сформировать полную модель, характеризующую активность как IKK, так и NF-κB в ответ на постоянный стимул TNFα (дополнительный файл 1: таблицы S1-S3).Прогнозы модели с использованием наборов параметров, оцененных по изолированным модулям сигнализации, давая хорошее согласие в течение первых 30 минут, предсказали более высокую амплитуду второй фазы активности NF-κB (дополнительный файл 1: рисунок S4), что не соответствовало данным ( Р <10 -6 ). Численное исследование показало, что это более колебательное поведение, предсказываемое интегрированной моделью, было связано с небольшими изменениями в более позднем профиле активации IKK, предсказанном восходящей моделью, который, как предполагалось, оставался на постоянном низком уровне при разработке изолированного нижестоящего сигнального модуля.После увеличения скорости ядерного импорта IκBα и повторной оценки скорости обратной связи A20 и рециклинга IKK, недавно разработанная модель смогла обеспечить хорошее согласие с данными с ошибками аппроксимации всего 0,34 для NF-κB (P = 0,013) и 0,43 для IKK (P = 0,291) (рис. 4C и 4D).

Прогноз модели подтвержден экспериментально

Учитывая, что модель была разработана с использованием ограниченного набора данных об активации IKK и NF-κB, мы затем попытались проверить ее способность прогнозировать динамику других модельных видов, для которых не использовалась информация во время оценка параметров.Модель была сначала смоделирована для получения уровней общего клеточного белка IκBα после стимула TNFα (рис. 4E). Модель предсказывала, что уровень белка остается относительно неизменным во время начальной задержки, но начинает снижаться через 5 минут. Через 20 минут модель предсказывает, что уровни белка IκBα были снижены более чем наполовину от их первоначальных количеств.

Чтобы проверить это предсказание экспериментально, клетки BV2 снова обрабатывали 10 нг / мл TNFα, и уровни общего клеточного IκBα измеряли в нескольких временных точках после обработки с помощью ELISA.Результаты экспериментов были нормализованы по отношению к начальным количествам и сопоставлены с предсказаниями моделирования (рис. 4E). Экспериментальные данные превосходно согласуются с предсказанными уровнями IκBα, обеспечивая уровень экспериментальной проверки модели.

Анализ модели подчеркивает свойства устойчивости сети и динамическую роль регулирования с обратной связью в передаче сигналов как NF-κB, так и IKK

Затем модель была проанализирована с использованием анализа чувствительности, чтобы получить более глубокое понимание того, как различные компоненты системы взаимодействуют для регулирования. динамический ответ NF-κB в микроглии.Анализы чувствительности регуляторной сети NF-κB были выполнены ранее [30–33] и внесли значительный вклад в понимание того, как работает система. Здесь мы расширяем эти исследования, рассматривая динамические траектории коэффициентов чувствительности и исследуя, как чувствительность реакции системы по отношению к параметрам сети изменяется со временем.

Нормализованные коэффициенты чувствительности для активации NF-κB были решены и построены в виде тепловых карт, чтобы проиллюстрировать динамические отношения между сигнальными компонентами и реакцией системы (рис. 5A).

Рисунок 5

Модельный анализ временной активации IKK и NF-κB в микроглии . Анализ чувствительности модели показывает, что динамический ответ NF-κB (A) и ответ IKK (B) по-разному регулируются разными группами параметров в зависимости от интересующего временного интервала. См. Дополнительный файл 1: Таблицы S2-S3 для полного описания параметров. (C) Сканирование параметров использовалось, чтобы найти евклидово расстояние между номинальным и возмущенным ответами NF-κB, поскольку параметры варьировались более чем на четыре порядка.Темные цвета указывают на незначительные изменения, а более светлые - на большие. (D) Смоделированные траектории из сканирования параметров для выбранных параметров из каждой группы показывают различия в том, как на систему влияют до +/- 10-кратные изменения от номинальных значений. См. Также Дополнительный файл 1: Рисунки S7 и S8.

Результаты чувствительности ясно показывают, что реакция NF-κB почти полностью нечувствительна к изменениям одних параметров скорости (ряды светло-зеленого цвета), но также умеренно или очень чувствительна к другим (темно-красный и синий) (рис. 5A), согласованно с более ранними результатами, которые показали, что только относительно небольшое количество сетевых параметров существенно влияет на активность NF-κB [30].Примечательной особенностью нашего анализа является то, что, за исключением скоростей перемещения ядра NF-κB ( ki1 и ke1 ), для которых показатели чувствительности остаются высокими на протяжении всего ответа, активность NF-κB демонстрирует высокую динамическую чувствительность с относительно большинства других параметров. Другими словами, существует сильный временной компонент регуляции активности NF-κB, где вариации различных параметров могут оказывать большое влияние на определенные фазы активности, но имеют лишь незначительное влияние на активацию в другие временные интервалы (Рисунок 5A и Дополнительный файл. 1: Рисунок S6).Первые 20 минут активности NF-κB преимущественно зависят от скорости IKK-индуцированного фосфорилирования, убиквитинирования и деградации, а также активации IKK, с небольшим вкладом со стороны параметров обратной связи. Поскольку IκBα деградирует и свободный NF-κB поднимается до своей максимальной активности, скорость перемещения свободного NF-κB в ядро ​​имеет наибольший эффект.

Однако система демонстрирует чрезвычайную чувствительность к скорости, регулирующей внутренний и внешний контуры обратной связи. Система очень чувствительна к скоростям индуцированного синтеза IκBα и его ассоциации с NF-κB в течение периода времени, совпадающего со снижением первого пика, при этом скорости синтеза и связывания отрицательно влияют на активацию NF-κB. Скорость преобразования инактивированного IKK обратно в нативный IKK ( kp, ) также является одним из наиболее важных параметров ослабления активности NF-κB. В то время как активность NF-κB находится на самом низком уровне между 60-90 мин, стабильность оставшихся транскриптов IκBα и индуцированное фосфорилирование, убиквитинирование и деградация IκBα оказывают большее влияние на уровни свободного NF-κB. Второй пик активности NF-κB в значительной степени регулируется скоростью ядерного импорта свободного IκBα, о чем свидетельствует высокая чувствительность ki3a только в этот период времени.Обратная связь от IκBα снова имеет очень значительный вклад в динамику второго пика, при этом индуцированный синтез IκBα и его сродство к несвязанному IκBα имеет очень высокую чувствительность.

Отклик NF-κB также очень чувствителен к внешнему контуру обратной связи A20 в зависимости от времени. Скорость инактивации IKK с помощью A20 существенно влияет на прекращение начальной активности NF-κB, а также на вторую фазу активности. Этот эффект вызывается ингибированием активации IKK, который недавно был преобразован из неактивной формы и стал доступным для активации; обратная связь от ингибирования A20 активации IKK играет менее существенную роль в динамике модели.Параметры внешней обратной связи, управляющие A20, действуют в противоположность скорости рециклирования IKK ( кПа) , чтобы регулировать этот ответ, что видно по противоположным знакам значений чувствительности на протяжении всего ответа.

Хотя многие особенности ответа NF-κB ранее были изучены с использованием анализа чувствительности, динамической чувствительности IKK уделялось мало внимания. Поэтому мы оценили параметрическую чувствительность активации IKK так же, как только что описано для NF-κB (рис. 5B).Активность IKK чувствительна к меньшему количеству параметров, чем NF-κB, что ожидается из-за меньшего количества реакций, вовлеченных в вышестоящий модуль, и его единственного прямого взаимодействия с нижележащим сигнальным путем, происходящего через обратную связь от A20. Как и в случае с NF-κB, чувствительность IKK также очень динамична, что подчеркивает динамическую природу ее регуляции во время начальной переходной и поздней фазы низкой активности. Первоначальный пик показывает только чувствительность к скорости активации ( ka ) и параметрам скорости инактивации, контролирующим величину ( ki ) и константу диссоциации ( kmmi ).Через двадцать минут после первоначального стимула, когда IKK в основном находится в своей инактивированной форме, реакция становится очень чувствительной к скорости рециклирования IKK и к синтезу, деградации A20 и скорости отрицательной обратной связи, которые составляют внешнюю петлю обратной связи. Ответ поздней фазы IKK также относительно чувствителен к скоростям, регулирующим индуцированный IκBα синтез и стабильность транскрипта, и в меньшей степени к его индуцированной деградации белка IκBα, что указывает на то, что динамика IKK все еще сильно связана с внутренней петлей обратной связи IκBα, несмотря на отсутствие прямых перекрестных реакций.

Хотя анализ чувствительности по отношению к небольшим изменениям является информативным, нелинейный характер системы делает возможным, что результаты могут отличаться при рассмотрении значительных изменений параметров [30]. Поэтому устойчивость реакции системы на большие изменения значений параметров оценивалась путем изменения каждого параметра на четыре порядка величины и вычисления евклидова расстояния между номинальным откликом NF-κB и откликом NF-κB, смоделированным при этих возмущенных параметрах (рис. 5C и 5D).Активность NF-κB остается относительно неизменной, когда многие параметры для перемещения ядра и деградации белка IκBα изменяются на значения, которые существенно отличаются от их оценочных значений, что указывает на то, что реакция системы относительно устойчива к изменениям этих параметров (рис. 5C). Исследование траекторий при значениях параметров, охватывающих два порядка величины, показывает, что действительно реакция остается аналогичной, когда скорости деградации белка варьируются в больших количествах, и что изменение скорости ядерного импорта IκBα изменяет амплитуду второго пика, но сохраняет в остальном аналогичный профиль (дополнительный файл 1: рисунок S7). В соответствии с результатами чувствительности (рис. 5A), в которых NF-κB был нечувствителен к уровням активации и инактивации для IKK, ответ NF-κB устойчив к изменениям этих значений параметров (рис. 5C). Только очень большие изменения в параметрах скорости активации IKK существенно изменяют реакцию, при этом гораздо более высокая скорость активации приводит к более колебательной реакции (дополнительный файл 1: Рисунок S8). Сканирование параметров также показывает, что система выдерживает до 5-кратных изменений в новых параметрах убиквитинирования и деградации, вызванных IκBα, при сохранении аналогичного ответа NF-κB, но со слегка смещенной синхронизацией первого пика (рисунок 5D и дополнительный файл 1 : Рисунок S7).Однако дальнейшее снижение частоты значительно уменьшило амплитуду ответа. Удивительно, но система относительно устойчива к темпам импорта и экспорта ядерных материалов ( ki1 и ke1 ), что является неожиданным с учетом результатов анализа чувствительности, в которых эти показатели были одними из самых чувствительных. Сильные изменения этих параметров изменяют уровень демпфирования во второй фазе отклика, но начальный пик остается почти идентичным (Рисунок 5D и Дополнительный файл 1: Рисунок S7).

В то время как реакция системы устойчива к большим изменениям многих значений параметров, система намного более чувствительна к изменениям скорости реакции, участвующей как во внутренней IκBα, так и во внешней петле обратной связи A20. В частности, профиль активации NF-κB значительно изменяется, когда скорости индуцированной транскрипции или трансляции изменяются только на небольшую величину, на что указывает большое расстояние между номинальной и нарушенной траекториями при этих значениях (Рисунок 5C). Изменения этих параметров в 3 раза значительно изменяют скорость ослабления отклика и изменяют частоту второй фазы активности (рисунок 5D и дополнительный файл 1: рисунок S7).Точно так же расстояние остается небольшим только для относительно узкого диапазона скоростей, близких к номинальным значениям для большинства параметров обратной связи A20, что указывает на то, что отклик системы заметно меняется, когда эти скорости существенно отклоняются от своих номинальных значений (Рисунок 5C). Значительные изменения параметров контура обратной связи A20 значительно изменяют как амплитуду, так и время второго пика, а также скорость затухания первого пика, но оставляют раннюю динамику относительно неизменной (рисунок 5D и дополнительный файл 1: рисунок S8).

Передача сигналов внутриклеточных антител регулируется фосфорилированием рецептора Fc TRIM21

Для исследования регуляции TRIM21 мы проверили, запускает ли избыточная экспрессия в отсутствие стимулов антител NFκB. В качестве положительного контроля мы сравнили его активность с активностью TRIM5α, родственного противовирусного белка TRIM, избыточная экспрессия которого достаточна для управления спонтанной передачей сигналов NFκB (Pertel et al., 2011). В то время как трансфекция полноразмерного TRIM5α вызвала дозозависимую активацию NFκB, полноразмерный TRIM21 не смог активировать NFκB при любой дозе (рис. 1A).При активации и TRIM21, и TRIM5α аутоубиквитинат, тем самым становясь деградирующим субстратом для протеасомы. В соответствии с результатом NFκB, в то время как эндогенный TRIM5α подвергался быстрой рециклингу, мы обнаружили мало свидетельств оборота TRIM21 даже через несколько часов (рисунок 1B и рисунок 1 - рисунок в приложении 1). Вместе эти наблюдения подтверждают, что либо TRIM21 конститутивно неактивен и его активность убиквитинирования строго регулируется, либо он является менее активной лигазой E3, чем TRIM5α.Однако сравнение активности убиквитинирования TRIM5α и TRIM21 изолированных RING-доменов (T5-R или T21-R) in vitro показало, что TRIM21 был более активным E3, способным образовывать убиквитиновые цепи в течение нескольких минут (рис. 1C). Димеризация RING посредством сборки более высокого порядка является предложенным механизмом, с помощью которого TRIMs саморегулируются (Wagner et al., 2016). Самосборка TRIM5α и мутации, нарушающие димеризацию RING, ингибируют каталитическую способность (Юдина и др., 2015). Поэтому мы ввели структурно соответствующие мутации в TRIM21 (рисунок 1D и рисунок 1 - рисунок в приложении 2), чтобы проверить, требуется ли димеризация RING для активности. SEC MALS и AUC продемонстрировали, что в то время как RING дикого типа находится в равновесии мономер-димер, мутанты M10E и M10E / M72E не подвергаются детектируемой димеризации (рис. 1E и F). Однако оба мутанта остаются активными и могут катализировать синтез неякоренной цепи K63, Ube2W-примированное заякоренное удлинение цепи K63 и разряд убиквитина (Figure 1G-I), хотя и менее эффективно, чем дикий тип. Эти результаты демонстрируют, что предварительно сформированный димер TRIM21 RING не является предпосылкой для активности убиквитинирования.

TRIM21 Передача сигналов NFκB конститутивно молчит, несмотря на синтез мономерной цепи RING K63.

( A ) Сверхэкспрессия TRIM5α (T5), но не TRIM21 (T21) в 293Ts активирует репортер NFκB-люциферазы. ( B ) Снижение уровней эндогенных белков Т5 и Т21 после обработки циклогексимидом. ( C ) (слева) Иммуноблоттинг для синтеза полиубиквитина in vitro, катализируемого доменами T5 или T21 RING ( R ) в присутствии Ube2N / Ube2V2; (справа) SDS-PAGE, показывающий автоубиквитинирование T21R в присутствии Ube2W и Ube2N / Ube2V2.( D ) Интерфейс димеризации RING в структуре T5 (4TKP). ( E – F ) Олигомеризация T21 R и мутантов M10E и M10E / M72E по оценке ( E ) SEC MALS и ( F ) AUC. ( G – H ) T21 R дикого типа (WT) или димеризационные мутанты, катализирующие синтез незакрепленного полиубиквитина с использованием Ube2N ( G ) или закрепленных цепей с использованием Ube2N / Ube2V2 и Ube2W ( H ). ( I ) T21 (WT или мутанты) катализирует выделение убиквитина из конъюгированного Ube2N / Ube2V2.

https://doi.org/10.7554/eLife.32660.003 Димеризация

RING не требуется для связывания фермента E2, поскольку все взаимодействия происходят в пределах одного мономера (Юдина и др. , 2015). Вместо этого полагают, что димеризация RING E3s необходима для дополнительных контактов с E2-заряженным убиквитином. Мутации в партнере RING на этом интерфейсе снижают каталитическую активность TRIM25 in vitro (Figure 2A) (Sanchez et al., 2016). Эквивалентные мутации в TRIM21 не влияли на убиквитинирование, подтверждая, что димеризация RING не является внутренним требованием для активности TRIM21 (Figure 2B-D).Мутация E10R снижает убиквитинирование с помощью TRIM25, возможно, за счет разрыва водородной связи с убиквитином (Koliopoulos et al., 2016). Мы предположили, что соответствующий глутамат (E13) в TRIM21 может позволить мономерному RING контактировать как с E2, так и с связанным убиквитином одновременно, что устраняет необходимость димеризации. В соответствии с этой гипотезой, E13R снижает катализ TRIM21 (рис. 2D). Взятые вместе, эти данные показывают, что мономерное TRIM21 RING представляет собой высокоактивный E3. Т.о., отсутствие конститутивной активности TRIM21 NFκB д. Быть результатом жесткой регуляции, независимой от олигомеризации более высокого порядка.

TRIM21 RING димеризация не требуется, чтобы катализировать высвобождение убиквитина из E2: Ub.

( A ) Модель комплекса TRIM25 RING: Ube2N: Ub (5EYA), демонстрирующая взаимодействия между убиквитином и обоими мономерами RING. ( B – D ) Убиквитинирующая активность WT T21R и мутантов предполагаемых остатков, контактирующих с убиквитином, во втором мономере.( B ) Катализ незакрепленных цепей убиквитина с использованием Ube2N. ( C ) Синтез закрепленных цепей K63 на TRIM21 в присутствии как Ube2N / Ube2V2, так и Ube2W. ( D ) Катализ выделения убиквитина из конъюгированного Ube2N / Ube2V2.

https://doi.org/10.7554/eLife.32660.006

Следующим доменом в трехчастном мотиве TRIM21 после RING является B-Box2 (далее именуемый «B-Box»), домен, в значительной степени уникальный для белков TRIM, но функция которого (помимо способности к олигомеризации в TRIM5α) заключается в неизвестный. Сравнение активности белков RING, RING-Box и MiniTRIM21 (на основе моновалентного MiniTRIM5, который сохраняет интерфейс спиральной спирали бокса (Wagner et al., 2016)), показало, что присутствие B-бокса значительно снижает убиквитинирование (рисунок 3А). Это связано с прямым ингибированием каталитической активности, поскольку B-Box предотвращал выделение убиквитина из Ube2D1 или Ube2N (рис. 3B). Чтобы понять, как B-Box модулирует катализ TRIM21, мы решили кристаллическую структуру 2 Å белка RING-Box (дополнительный файл 1).Неожиданно оказалось, что B-Box занимает сайт связывания E2 в домене RING (рис. 3C). Сравнение с комплексом TRIM5α RING: E2 показывает, что B-Box расположен там, где спираль 1 E2 обычно должна располагаться во время связывания RING (рис. 3D). Важно отметить, что B-Box способен занимать сайт связывания E2 на RING, действуя как имитатор E2, образуя аналогичные электростатические взаимодействия. Поверхность RING содержит отрицательно заряженный участок, который дополняет сильно положительно заряженный участок как на E2, так и на B-Box (рис. 3E).В частности, взаимодействие Box-RING стабилизируется через солевой мостик между остатками R118 и E12, который аналогичен взаимодействию между остатком R14 E2 и остатком RING E11 в структуре TRIM5: Ube2N (рис. 3D). Чтобы напрямую проверить, предотвращает ли B-Box связывание E2, мы присвоили 15 N HSQC-спектры мономерных (M10E) конструкций RING и RING-Box и измерили возмущения химического сдвига (CSP) при титровании Ube2N (Рисунок 4 и Рисунок 4 - рисунок приложение 1). Титрование Ube2N в RING привело к значительным CSP в интерфейсных остатках E2 (обозначенных зелеными заштрихованными областями на рисунке 4A).Напротив, никаких доказательств связывания Ube2N с RING-Box не наблюдалось. Взятые вместе, эти данные предполагают, что B-Box может быть аутоингибиторным доменом, функция которого состоит в регуляции активности RING путем предотвращения рекрутирования E2.

The Box - это аутоингибиторный домен, который подавляет активность лигазы E3.

( A ) Катализ управляемого Ube2N / Ube2V2 синтеза полиубиквитиновой цепи с помощью T21 RING ( R ), RING-Box (RB) и MiniTRIM21 (MT).( B ) T21 R или RB катализируют выделение убиквитина из Ube2D1 или Ube2N. ( C ) 2 Å Рентгеновская структура T21 RB, окрашенная доменом с ионами цинка в голубом цвете. ( D ) Совмещение T21 с T5 модели 4TKP (серый), показывая, что Ube2N и Box структурно конкурентоспособны. ( E ) Поверхностное представление (слева направо) сайтов связывания T21 R, Box и Ube2N, окрашенных электростатическим потенциалом от -5 кТл / э (красный) до + 5 кТ / э (синий).

https: // doi.org / 10.7554 / eLife.32660.007
Коробка предотвращает связывание фермента E2 с RING E3.

( A ) Возмущения химического сдвига, зарегистрированные при добавлении немаркированного Ube2N в 15 N, помеченное TRIM21 RING (R) (вверху) или RING-Box (RB) (внизу). Взаимодействующие области E2 выделены зеленым цветом, а элементы вторичной структуры, содержащие спирали (прямоугольники) или b-нити (стрелки), указаны в верхней части каждого графика.(B) Примеры спектров HSQC 15 N; остатки в КОЛЬЦЕ (вверху) смещаются при добавлении E2 (соотношение КОЛЬЦО: E2: черный 1: 0, синий, 1: 0,5, красный, 1: 1), в то время как те же остатки в поле КОЛЬЦО (внизу) мало или нет движения в точке титрования 1: 1 (красный). На рис. 4 - дополнение к рисунку 1 показаны полные спектры.

https://doi.org/10.7554/eLife.32660.008

Затем мы исследовали, что снимает ингибирование B-Box и способствует активности убиквитинирования TRIM21.Недавно было показано, что неродственные адаптеры врожденного иммунитета, включая MAVS, STING и TRIF, содержат короткий IS-мотив p L x (где p гидрофильный, x неароматический, а S - целевой серин) , который рекрутирует киназы IKKβ или TBK1, что приводит к фосфорилированию серина и усилению сигнала (Liu et al. , 2015). Примечательно, что TRIM21 содержит очень похожий мотив на конце своего домена RING. Более того, серин-мишень в этом мотиве расположен в центре интерфейса B-Box: RING (фиг. 5A) и подвергается фосфорилированию в клетках (фиг. 5B).Мы предположили, что это может обеспечить механизм активации TRIM21 во время иммунного ответа. Для дальнейшего исследования мы подняли специфическую антисыворотку против фосфосеринового пептида 67 RQLANMVNNLKEISQ 81 (рис. 5C). Используя эту сыворотку против pS80, мы обнаружили клеточное фосфорилирование TRIM21, но не мутанта S80A, при сверхэкспрессии IKKβ (фиг. 5D). Чтобы убедиться, что IKKβ действует напрямую, а не индуцирует экспрессию второй киназы через NFκB, мы повторили эксперимент в присутствии ингибитора протеасом бортезомиба, который ингибирует деградацию IκBα и блокирует активацию NFκB.Эффективное фосфорилирование IKKβ TRIM21 наблюдалось даже в условиях, когда передача сигналов NFκB была отменена (рис. 5E). Чтобы подтвердить, что IKKβ непосредственно фосфорилирует TRIM21, мы инкубировали рекомбинантные белки RING-Box и IKKβ in vitro, наблюдая АТФ-зависимое фосфорилирование IKKβ TRIM21, которое было потеряно при мутации остатков мотива или добавлении ингибитора IKKβ (рис. 5F – H). Устойчивое IKKβ-опосредованное фосфорилирование также наблюдалось с использованием полноразмерного белка TRIM21 (рис. 5I). Наконец, нокаут IKKβ с помощью CRISPR / Cas9 отменяет модификацию сверхэкспрессированного TRIM21-His (фиг. 5J), что позволяет предположить, что эндогенная киназа фосфорилирует TRIM21.

TRIM21 содержит мотив
p LxxIS в своем RING-домене и фосфорилируется in vitro и в клетках.

( A ) Остаток S80 (желтые сферы) расположен в центре интерфейса Box: RING и является частью эпитопа, связанного с мотивом фосфорилирования IKKβ, обнаруженным в TRIF. ( B ) МС / МС-спектры TRIM21-His, очищенного из 293 Т-клеток, указывающие на присутствие фосфорилированного S80 (pS80) в предшественнике триптического пептида / m / z / 680.3 ± 0,39 частей на миллион. ( C ) ELISA антисыворотки против pS80 в концентрации 1: 50000 против рекомбинантного WT или pS80 TRIM21. ( D ) IKKβ фосфорилирует WT, меченный His на С-конце, но не S80A T21-His, как обнаружено с помощью специфических поликлональных сывороток pS80. ( E ) Как D, за исключением присутствия 30 нМ бортезомиба (Btzb) или ДМСО и, ниже, стимуляции NFκB посредством IKKβ параллельно. ( F – H ) Фосфорилирование T21 RB с помощью IKKβ in vitro с увеличением АТФ ( F ), нарушение фосфорилирования S80A и I79R RB ( G ) в присутствии 20 мкМ ингибитора IKKβ TPCA-1 ( H ).( I ) Фосфорилирование IKKβ in vitro полноразмерного липоил-Т21. ( J ) Фосфорилирование T21-His WT или S80A из контрольных клеток 293T (spCas9) или клеток 293T с делецией IKKβ (spCas9 / sgIKKβ).

https://doi.org/10.7554/eLife.32660.010

Ранее было показано, что в то время как MAVS фосфорилируется IKKβ и TBK1, STING и TRIF фосфорилируются только TBK1, что позволяет предположить, что существует дифференциальная киназная зависимость, даже несмотря на то, что сигнальные адаптеры имеют общий консенсус p L x IS-мотив (Liu и другие. , 2015). Чтобы проверить, является ли TRIM21 субстратом для фосфорилирования TBK1, мы инкубировали рекомбинантный полноразмерный белок с киназой в присутствии АТФ. TBK1 был способен фосфорилировать TRIM21 in vitro по сравнению с IKKβ (фиг. 6A). Сверхэкспрессия TBK1 также была способна сильно фосфорилировать клеточный TRIM21 и вызывать значительную стабилизацию белка (фиг. 6B). Чтобы преодолеть ограничения сверхэкспрессии киназы, мы стремились стимулировать фосфорилирование TRIM21 путем активации восходящего пути.Во-первых, мы стимулировали путь TBK1 путем экспрессии одного из его вышестоящих адаптеров, MAVS. Экспрессия MAVS значительно увеличивала фосфорилирование TRIM21 (фиг. 6C). Во-вторых, мы стимулировали клетки лигандом MDA5 / RIG-I poly (I: C) (Kato et al., 2008). Мы наблюдали быстрое увеличение фосфорилирования TRIM21 после стимуляции поли (I: C), что согласуется с активацией TBK1 (рис. 6D). Наконец, мы отслеживали изменения в фосфорилировании TRIM21 после заражения аденовирусом, покрытым антителами, в условиях, когда мы ранее продемонстрировали TRIM21-зависимую противовирусную активность (McEwan et al. , 2013). Данные показывают, что при эквивалентных уровнях иммунопреципитированного TRIM21 наблюдается значительное увеличение доли фосфорилированного TRIM21 (фиг. 6E).

TRIM21 фосфорилируется при иммунной стимуляции.

( A ) Фосфорилирование полноразмерного рекомбинантного белка липоил-Т21 in vitro с помощью IKKβ и TBK1.( B – C ) Экспрессия TBK1 ( B ) или вышестоящего адаптера MAVS ( C ) в Т-клетках 293 фосфорилирует и стабилизирует Т21, меченный His на С-конце. ( D ) Т-клетки 293, лишенные Т21, восстановили с помощью His-меченного Т21 и провоцировали поли (I: C). Повышенное фосфорилирование Т21 выявляется иммуноблоттингом с антисывороткой pS80. ( E ) Как и в ( D ), за исключением клеток, инфицированных аденовирусом 5 (AdV) в присутствии IgG и иммунопреципитации T21 через 7 часов после инфицирования.

https://doi.org/10.7554/eLife.32660.011

Затем мы исследовали, может ли фосфорилирование серина действовать как переключатель для снятия ингибирования B-Box и активации TRIM21. Чтобы проверить это, мы ввели фосфомиметическую мутацию S80E в RING-Box и измерили ее способность катализировать разряд убиквитина. Примечательно, что введения S80E в RING-Box было достаточно, чтобы полностью восстановить каталитическую активность до того же уровня, что и только RING (рис. 7A – B).Хотя глутамат является обычно используемым фосфомиметиком, он не полностью воспроизводит фосфосерин. Поэтому мы использовали эволюционировавшую ортогональную пару аминоацил-тРНК синтетаза / тРНК CUA (Rogerson et al., 2015) для включения фосфосерина котрансляционно в положение 80 в белке MiniTRIM21. Сравнение с белком дикого типа показало, что фосфорилирование S80 усиливает активность убиквитинирования TRIM21 (фиг. 7C). Зависимость от фосфорилирования была подтверждена обработкой фосфопротеина фосфатазой, которая дефосфорилирует S80 и восстанавливает аутоингибирование (фиг. 7C).Взятые вместе, это показывает, что модификации S80 достаточно для контроля активности убиквитинирования TRIM21 в присутствии B-Box. Более того, мутант S80E можно использовать в качестве функционального имитатора фосфорилирования серина в положении 80.

Фосфорилирование S80 или фосфомиметическая мутация S80E снимает ингибирование Box и способствует активности убиквитинирования TRIM21.

( A – B ) Катализ выделения убиквитина из Ube2D1 ( A ) или Ube2N ( B ) с помощью TRIM21 RING ( R ), RING-Box (RB) или RING-Box, содержащих мутацию S80E.Фосфомиметической мутации достаточно для придания RING-подобной кинетике разряда на RING-Box (смещенные графики). ( C ) (вверху) Катализ убиквитиновой цепи с помощью MiniTRIM21 либо WT, либо с фосфосерином, включенным ко-трансляционно в положение 80 посредством супрессии янтарным цветом (pS80). WT и pS80 MiniTRIM21, промотированные сыворотками pS80 или T21 (вверху справа) или после обработки лямбда протеинфосфатазой (LPP) (внизу справа). LPP дефосфорилирует S80 и восстанавливает аутоингибирование Box.

https: // doi.org / 10.7554 / eLife.32660.012

Приведенные выше данные предполагают, что TRIM21 поддерживается в конститутивно неактивном состоянии за счет B-Box-домена, который предотвращает связывание E2 и чье аутоингибирование высвобождается при фосфорилировании. Чтобы проверить это, мы сравнили активацию NFκB мутантами TRIM21 S80E или S80A с TRIM5α. Ни S80A, ни TRIM21 дикого типа не запускали NFκB, но S80E давал устойчивую активацию (фиг. 8A). Напротив, мутация остатка S80 не изменила нейтрализацию вируса (фигура 8B).Это согласуется с предыдущими данными о том, что передача сигналов TRIM21 имеет порог активации, тогда как нейтрализация не имеет (Foss et al., 2016). Чтобы продемонстрировать важность фосфорилирования TRIM21 для иммунного зондирования во время инфекции, мы провоцировали клетки, экспрессирующие различные мутанты TRIM21, аденовирусом человека (Adv) ± человеческий сывороточный IgG и измеряли транскрипцию TNFA через 4 часа. Значительная индукция TNFA наблюдалась только во время инфицирования в присутствии антитела, а не в клетках с нокаутом TRIM21 (K21, фигура 8C и фигура 8 - приложение к фигуре 1).Нормальная индукция TNFA восстанавливалась в клетках K21 сверхэкспрессией TRIM21, подтверждая TRIM21-зависимость. Важно отметить, что экспрессия S80A не способна спасти индукцию TNFA , тогда как S80E позволяет индукцию TNFA сверх уровней дикого типа. Изменение фосфорилирования TRIM21 при инфицировании не может быть обнаружено, но это может быть связано с тем, что только часть клеточного TRIM21 рекрутируется и модифицируется во время ответа. Это согласуется с предыдущими данными, показывающими, что убиквитинирование и деградация TRIM21 также не поддаются обнаружению, несмотря на то, что они необходимы для активности (Mallery et al., 2010). Чтобы подтвердить важность ингибирования S80 и B-Box в регуляции передачи иммунных сигналов TRIM21, мы повторили наши эксперименты с инфекцией, используя неродственный РНК-вирус, человеческий риновирус 14 (HRV). Как и в случае с AdV, экспрессия TRIM21 дикого типа в нокаут-клетках увеличивала индукцию TNFA при инфицировании антителом против HRV + (фиг. 8D). Мутант S80E значительно усиливал транскрипцию TNFA , тогда как S80A не мог восстановить активность TRIM21. Аналогичные результаты были получены для цитокинов CXCL10 и IL6 и стимулированного интерфероном гена IFIT1 .

Аутоингибирование B-Box регулирует антитело-зависимую иммунную передачу сигналов с помощью TRIM21.

( A ) Активация NFκB в 293T, экспрессирующих WT, S80A или S80E T21 или WT T5. Фосфомиметической мутации S80E достаточно, чтобы сделать TRIM21 конститутивно активным для активности NFκB. ( B ) Нейтрализация аденовирусов восстанавливается в MEF, нокаутированных по Т21 ( K21 ), в равной степени при сверхэкспрессии мутантами WT или S80. ( C ) T21-опосредованная индукция TNFA при аденовирусной (AdV) инфекции в присутствии антитела (Ab) восстанавливается в K21 за счет сверхэкспрессии WT TRIM21, но не S80A, тогда как S80E является гиперактивным. Кратность изменения транскриптов TNFA , как определено с помощью КПЦР. ( D ) Транскрипция иммунного гена, индуцированная покрытым антителом риновирусом человека (HRV) в восстановленных MEF. Мутация фосфомиметика S80E усиливает активацию транскрипции с помощью TRIM21, тогда как S80A подавляет активность.

https://doi.org/10.7554/eLife.32660.013

Чтобы получить прямые доказательства того, что фосфорилирование S80 активирует TRIM21, замещая домен B-Box, мы сравнили связывание E2 белков дикого типа и S80E RING-Box с помощью ЯМР. В отличие от дикого типа, мы обнаружили значительные CSP в остатках канонического сайта связывания E2 при титровании Ube2N в S80E (рис. 9A). Также были изменения в остатках в основании спирали 2, внутри линкера и в остатках B-Box, которые контактируют с RING. Это согласуется с восстановлением связывания E2 и стабилизацией активной конформации, в которой смещен домен B-Box. Чтобы дополнительно продемонстрировать смещение B-Box, мы сравнили динамику белков дикого типа и S80E. Отношения { 1 H} 15 N NOE показывают, что наиболее динамичной областью является линкер (остатки 83–102) между RING и B-Box (фигура 9B). Это согласуется с более высокими температурными факторами, наблюдаемыми для этих остатков в кристаллической структуре (Рисунок 9 - приложение к рисунку 1).Важно, что мутант S80E имеет заметно более низкие факторы усиления как в линкерной области, так и в спирали 1 (остатки 1-17), против которых упаковывается B-Box (Рисунок 9B). Это усиление локального движения согласуется с уменьшением взаимодействия между RING и B-Box у мутанта S80E. Чтобы продемонстрировать, что смещение B-бокса способствует доступу к сайту связывания E2 на RING, мы провели эксперименты по усилению парамагнитной релаксации (PRE растворителя). В этих экспериментах добавление парамагнитного металлического комплекса Gd (DTPA-BMA) избирательно ослабляет сигналы от поверхностей, подверженных воздействию растворителя (Pintacuda and Otting, 2002). Мутация S80E вызвала резкое изменение в доступности поверхности, точно локализованной в интерфейсе RING-Box (рис. 9C и дополнительный файл 2). Эти данные подтверждают, что фосфомиметическая мутация серина 80 нарушает взаимодействие RING: Box и раскрывает сайт связывания E2.

Фосфомиметическая мутация S80E вытесняет Box из КОЛЬЦА и позволяет связываться с ферментом E2.

( A ) Сравнение возмущений химического сдвига при титровании ферментом E2 Ube2N в T21 RB (серый) или T21 RB S80E (черный). Взаимодействующие области E2 выделены зеленым цветом, а вторичная структура обозначена прямоугольниками (спирали) и стрелками (β-тяжи). ( B ) Сравнение гетероядерных NOE для T21 RB (серый) или T21 RB S80E (черный) в отсутствие E2. Данные согласуются с повышенной динамикой в ​​линкерной области между RING и Box после введения S80E. ( C ) Относительное воздействие растворителя в S80E по сравнению с WT, как определено с помощью PRE растворителя (показано как соотношение интенсивностей WT / S80E, отображенное на структуре RB; первичные данные в дополнительном файле 2). Белые области указывают на области, более подверженные воздействию растворителя в WT, а красные области указывают на части поверхности, более подверженные воздействию растворителя в S80E.

https://doi.org/10.7554/eLife.32660.015

NF-κB и внешние пути гибели клеток - связанные решения «сделай или умри» для Т-клеток

Основные моменты

Киназы, такие как IKK, выполняют двойную функцию, активируя NF-κB и подавляя пути гибели клеток независимо от NF-κB активация.

Защита зрелых тимоцитов от TNF-индуцированной гибели клеток, по-видимому, опосредуется исключительно прямой репрессией RIPK1 комплексом IKK, а не активацией NF-κB.

Развитие и гомеостаз обычных и регуляторных Т-клеток (Tregs) основывается на передаче сигналов через отдельные члены суперсемейства рецепторов TNF (TNFRSF), которые активируют определенные димеры NF-κB.

Наивная выживаемость Т-клеток в основном опосредуется RelA и членами TNFRSF, включая TNFR1 и CD27.

На основании исследований на мышах, Tregs требуют c-Rel для развития и RelA для функциональной компетентности. Рецепторы TCR, TNFR2, GITR и OX40 являются ключевыми триггерами активности NF-κB в Treg.

Смерть клеток и сигнальные пути NF-κB находятся в стадии регуляции развития в Т-клетках на уровне экспрессии RIPK1 и MLKL; это определяет, как и когда доставляются сигналы во время онтогенеза Т-клеток и какие способы гибели клеток могут быть запущены.

Передача сигналов NF-κB необходима на нескольких стадиях развития и функционирования Т-клеток.Путь NF-κB объединяет сигналы от многих рецепторов и включает различные адаптеры и киназы. Недавние достижения демонстрируют, что киназы, контролирующие активацию NF-κB, такие как комплекс IKK, выполняют двойные независимые функции, потому что они также контролируют контрольные точки гибели клеток.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *